红背叶根提取物对Con_A致小鼠急性肝损伤的保护作用研究_沈海容_杨静雯_朱晓霞

1、红背叶根提取物对Con_A致小鼠急性肝损伤的保护作用研究_沈海容_杨静雯_朱晓霞 1266 辽宁中医杂志2014年第41卷第6期 DOI1013192/jissn1000-1719201406083 红背叶根提取物对ConA致小鼠急性肝损伤的保护作用研究 杨静雯，朱晓霞，陈淳，陈育尧，刘强，黄少慧，吕志平沈海容， （南方医科大学中医药学院，广东广州510515） 要：目的:探讨红背叶根4种提取物:水提物，石油醚提取物，乙酸乙酯提取物，正丁醇提取物对ConA诱导的小 鼠急性肝损伤的保护作用。方法:尾静脉注射ConA诱导小鼠急性免疫性肝损伤。检测小鼠血清谷丙转氨酶、谷草转氨 摘 酶;观察小鼠肝脏组

2、织结构变化情况。结果:红背叶根4种不同提取物不仅可显著降低血清中谷丙转氨酯、谷草转氨酶，还可以改善肝脏的组织形态。结论:红背叶根4种不同提取物对ConA诱导的免疫性肝损伤具有显著的保护作用。 关键词：红背叶根提取物;ConA;急性肝损伤 1719（2014）06-1266-03中图分类号：332文献标志码：B文章编号：1000-StudyonProtectiveEffectsofHongbeiyegenExtractsagainst AcuteLiverInjuryinMiceinducedbyConA SHENHairong，YANGJingwen，ZHUXiaoxia，CHENChun，C

3、HENYurao，LIUQiang，HUANGShaohui，LYUZhiping（CollegeofTraditionalChineseMedicine，SouthernMedicalUniversity，Guangzhong510515，Guangdong，China）Abstract：Objective：Toinvestigatetheprotectiveeffectof4Hongbeiyegenextracts：waterextract（WE），petroleumetherex-tract（PE），ethylacetateextract（EE），nbutanolextract（BE）a

4、gainstacuteliverinjuryinmiceinducedbyConAMethods：ImmunologicalliverinjurywasinducedinmicebyConAinjectedviathetailveinTheserumlevelsofalanineaminotransferase（ALT）andaspartateaminotransferase（AST）weredeterminedAndthechangesofstructureoflivertissueinmicewereobservedbytheliverpathologicalexaminationesul

5、ts：4HongbeiyegenextractscannotonlysignificantlyreducetheserumlevelsofALTandAST，butalsoimprovethemorphologyofliverConclusion：4HongbeiyegenextractsoffersignificantprotectiveeffectagainstimmunologicalliverinjuryinmiceinducedbyConA Keywords：Hongbeiyegenextracts；ConA；acuteliverinjury 肝损伤是贯穿各种肝脏疾病的病理现象以及病

6、变 结果，因此肝损伤的发病机制和抗肝损伤药物一直是从事肝病的医务工作者们比较重视的以及比较热门的一个研究领域。而研究肝损伤的发病机制和保肝药物的作用原理需要建立合适的实验性肝损伤动物模型。因此，在抗肝炎药物研究中可采取损伤机制不同的多个模型上观察药物的保护作用，以综合判断药物疗效 1 和作用机制。本课题组前期对红背叶根的研究采用 2 四了卡介苗+脂多糖诱导小鼠免疫性肝损伤模型， 3 但是未使用过氯化碳诱导的化学性肝损伤模型， ConA诱导的肝损伤模型，为了综合判断红背叶根的药物疗效，我们在本实验中使用了ConA诱导的急性肝损伤模型，对红背叶根4种不同提取物进行实验 收稿日期：20131212

7、基金项目：广东省科技计划项目（2009A030100009）；广州市科技计划项 目（2008Z1E4611） 作者简介：沈海容（1980），女，广西横县人，主治医师，博士研究生，研 究方向：中西医结合肝病的临床与实验研究。 通讯作者：吕志平（1956），男，广东惠州人，教授，博士研究生导师，研 Email：lzping究方向：中西医结合肝病的临床与实验研究，fimmucom。 研究，以进一步探讨、筛选红背叶根保肝作用的有效部 位，为其保肝作用提供实验依据。1材料与方法1.1材料 1.1.1实验动物NIH小鼠，SPF级，体质量1822g，150只，动雄性（南方医科大学实验动物中心提供）， 合格证

8、号：物许可证号：SCXK（粤）20110015， 4402101394。实验期间的颗粒饲料由南方医科大学实验动物中心提供。实验环境：动物房保持通风、干燥、室温2225，湿度5070%，自由饮水，鼠料定量饲养。 1.1.2药物红背叶根采自广东惠州，经南方医科大学中药鉴定与药用植物教研室陈兴兴老师鉴定为大戟科植物红背山麻杆Alchorneatrewioides（Benth.）Muell.Arg.的根。红背叶根4种不同提取物：水提 石油醚提取物（PE），乙酸乙酯提取物（EE），物（WE）， 正丁醇提取物（BE）由南方医科大学中医药学院中药制剂教研室提取。4种不同提取物均分高、中、低剂量组，按药效学原

9、则与蒸馏水混合制成水溶液。阳性对照药甘利欣（江苏正大天晴药业股份有限公司，批号：120411102） 1.1.3试剂与仪器主要试剂：ConA（Sigma进口 辽宁中医杂志2014年第41卷第6期 ALT、AST检测试剂盒（广州分装，批号：24H10131）， 标佳科技有限公司）。主要仪器：全自动生化分析仪（BECKMAN）；DK8AD型电热恒温水槽（上海一恒科技有限公司）；OlympusBH2型显微镜（日本O-lympus）；PM20型显微摄像系统（日本Olympus）；离心机（Thermo）1.2实验方法 1.2.1动物分组与处理及造模150只NIH雄性小 ConA模型组、鼠随机分成正常对照

10、组、阳性对照药 甘利欣组及红背叶根WE高、中、低剂量组；PE高、中、低剂量组；EE高、中、低剂量组；BE高、中、低剂量组等15个组，每组10只。实验开始后，红背叶根4个不同 1 7.8g提取物分别按药效学原则，以3.9g生药/kg， 1 15.6g生药/kg1为低、中、高剂量灌胃给生药/kg， 药，阳性对照药甘利欣按100mg/kg的剂量灌胃给药，正常对照组和ConA模型组以等体积生理盐水灌 0.5ml/只1/d1，连续给药3d，末次给药1h后，模胃， 型组及各给药组尾静脉注射ConA溶液（无菌生理 1 注射剂量为安全剂量15盐水配制成1.5mg/mL， 1 mg/kg）诱导小鼠急性免疫性肝损

11、伤，正常对照组注 8h后摘眼球采射等量的无菌生理盐水，禁食，不禁水， 1 取血清超低温冰血，血液3000rpm/min离心10min， 箱冻存以备下一步检测所需；处死动物，取肝脏同一部 10%中性福尔马林固定。位， 1.2.2ALT和AST的检测南方医科大学中西医结合医院检验科全自动化分析仪检测。1.2.3肝组织病理学检查常规脱水，石蜡包埋切片 HE染色，（4微米），光镜下观察肝组织病理学变化。 4 肝组织结构将肝组织损伤程度分为4级：0级（）， 正常，无明显变性、坏死及炎症细胞浸润；级（+），肝小叶结构尚正常，可见部分肝细胞混浊肿胀，气球样变或脂肪变性，散在点状坏死；级（+），肝小叶结构不清

12、，可见明显的灶状坏死，伴有炎症细胞浸润； 肝小叶结构不清、可见明显的片状坏死，级（+）， 伴有炎症细胞浸润。 1.2.4统计方法实验数据用统计软件SPSS13.0 珋s）表示，进行分析，计量资料用均数士标准差（x组间 比较用onewayANOVA。方差齐性时，采用LSD方法进行组问多重比较；方差不齐时，采用DunnettT3方法进行组间多重比较。多组等级/频数表资料用非参数检验中的KIndependentSamplesTests进行数据处理，两组等级资料用非参数检验中的2IndependentSamplesTests进行数据处理（以P=0.05/14为校正检验水准）。P0.05定为差异有统计学

13、意义。2结果 2.1红背叶根对免疫性肝损伤小鼠血清转氨酶的影响 AST见表1，与正常组相比较，模型组血清ALT、 表明ConA干预后对小鼠水平显著升高（P0.01）， 肝细胞造成了严重的损伤，动物模型建立成功。红背 PE、EE，BE各个剂量组以及甘利欣组与模叶根WE、 与药物剂量增加型组比较均有显著差异（P0.01）， 无明显关系。红背叶根4个不同提取物的组间比较，BE的中剂量组的ALT水平最低，BE的低剂量组的AST水平最低，可见4种提取物中BE降低转氨酶的效果是最好的。 表1 1267 红背叶根不同提取物对小鼠血清ALT和AST的影响（n=10）组别正常对照组模型组WE低剂量组WE中剂量组

14、WE高剂量组PE低剂量组PE中剂量组PE高剂量组EE低剂量组EE中剂量组EE高剂量组BE低剂量组BE中剂量组BE高剂量组甘利欣组 ALT（U/L）45.9018.141258.33566.84a 74.3836.78b82.5026.22b70.0034.76b113.7556.93b78.0039.17b81.4239.44b145.6289.10b161.2576.38b52.2223.33b58.0019.03b45.569.82b72.5035.56b98.1248.61b AST（U/L）192.2771.421539.17549.59a 216.8867.19b220.0034.9

15、2b179.2871.20b259.3896.45b208.0098.01b204.2964.25b263.75116.18b311.25116.98b165.5650.71b153.5027.19b155.0041.76b204.3850.32b219.3774.80b abP0.01；与模型组比较，P0.01。注：与正常组比较， 红背叶根对急性免疫性肝损伤小鼠肝脏组织结 构的影响 2.2.1肉眼观察型组肝脏肿大，表面有大小不等的坏死斑。红背叶根4种不同提取物组、阳性药物对照组肝脏变化较模型组轻。正常组肝脏未见明显异常。2.2.2光镜观察本实验在遵循肝损伤病理等级分级的原则下分别从肝细胞变性

16、和肝细胞坏死两方面评价红背叶根对肝组织形态的改善效果。表2显示，肝 2 P=0.000；肝细胞坏死方细胞变性方面，=57935， 2 P=0.000；表明各组疗效存在显著性面，=41751， 差异。与正常组相比较，模型组肝脏变性及坏死等病 动物模型建立成功。理变化特别显著（P0.05/14）， 在肝细胞变性方面，各给药组改善肝脏变性的效果差 PE的中剂量组，EE的异不显著。在肝细胞坏死方面， BE的低、高剂量组、中剂量组以及甘利欣组减轻肝细 这3种提取物胞坏死的效果差异显著（P0.05/14）， BE有两个剂量组有效，中，且这两个剂量组的秩次与正常组的秩次接近，提示BE的效果是最好的；镜下观察

17、结果见表2和插页图115（HE染色200）。 插页图115各组小鼠肝脏病理切片（HE染色200） 3讨论 大量的临床及实验研究表明中药在治疗肝脏疾病有其多途径、多层次、多靶点的作用，具有资源丰富，价 。广东是有名。“岭南出好药”格便宜，疗效好等优点 的中医药大省，中药资源十分丰富，药材种类占全国的20.7%。南药是祖国医药宝库中的一枝奇芭。红背叶根是南药的一种，为双子叶植物药大戟科植物红背山麻杆Alchorneatrewioides（Benth.）Muell.一Arg.的根。别名为红灵丹、红罗裙、红帽顶、红背娘、红骨白颧 5 性平。具有清热解毒，祛风除湿，散树根。其味甘， 瘀止血，平喘，杀虫止

18、痒等作用。也用于治疗各型肝炎，是民间常用的保肝治肝药物。本课题组前期研究 2.2 1268 发现红背叶根具有较好的抗肝纤维和抗肝损伤作23，6 。临床实践表明红背叶根具有抗乙肝病毒功用7 筛选红背叶根保肝作用的有效效。为进一步探讨、 部位，我们用4种不同的提取方法对红背叶根进行药物的部位提取，然后采用ConA诱导小鼠急性肝损伤模型对这4种不同提取物进行实验研究。 表2组别 红背叶根提取物对各组小鼠的肝组织形态学的影响（n=10）肝细胞变性+ 632242654057676 138768445723134 040100001300100 P值34.90 101.85117.7495.6578.3

19、091.4065.2068.1182.55117.2550.9458.6549.2558.6565.20 * 辽宁中医杂志2014年第41卷第6期 了综合判断红背叶根不同提取物的确切疗效和作用机制，我们本次实验采用了ConA诱导小鼠急性肝损伤模型。 本实验结果显示，在肝功方面，红背叶根4种不同提取物都可显著降低血清中谷丙转氨酯、谷草转氨酶； BE的中剂量红背叶根4个不同提取物之间组间比较， BE的低剂量组的AST水平最低，组的ALT水平最低， 可见4种提取物中BE降低转氨酶的效果是最好的。在肝脏组织形态方面，各组疗效存在显著性差异。与正常组相比较，模型组肝脏变性及坏死等病理变化特 动物模型建立

20、成功。在肝细胞别显著（P0.05/14）， 变性方面，各给药组改善肝脏变性的效果差异不显著。 PE的中剂量组，EE的高剂量组、在肝细胞坏死方面， BE的低、中剂量组以及甘利欣组减轻肝细胞坏死的效果差异显著（P0.05/14）。这3种效果差异显著的 BE有两个剂量组有效，提取物中，且这两个剂量组的 秩次与正常组的秩次接近，提示BE的效果是最好的； 4种提取可见在降低转氨酶，改善肝脏组织形态方面， 物中以BE的效果最佳。 参考文献1唐云安，J卫生毒理刘玉清，王国钦肝损伤动物模型研究进展2002，16（4）：236238学杂志，2宋雨鸿，刘强，陈育尧，等红背叶根对小鼠免疫性肝损伤的保护J南方医科大学

21、学报，2008，28（3）：494496作用3黄洁春，吕志平，刘强，等红背叶根提取物对四氯化碳致小鼠肝J陕西中医，2011，32（1）：113115损伤的作用研究4闫冰，姚卫峰，等二至丸保肝活性成分群对CCl4致小鼠蔡秀江， 中国中药杂志，2012，37（9）：1303急性肝损伤保护作用研究J 1305 5广东中药志编辑委员会广东中药志（第二卷）M广州：广东 1996：365367科技出版社出版，6吕小燕，刘强，吕志平红背叶根拮抗酒精性肝纤维化大鼠模型的J南方医科大学学报，2007，27（2）：1535作用机理研究7吕志平红背叶根在制备治疗慢性肝炎药物中的应用：中国， 200610，12230

22、748TiegsG，HentschelJ，WendelATCelldependentexperimentalliver injuryinmiceinduciblebyconcanavalinAJJClinInvest，1992，90（1）：196203 9GanmerF，LeiatM，LohseAW，etalConcanavalinAinducedTCell mediatedhepaticinjuryinmice：TheroleoftumornecrosisfactorJHepatology，1995，21（1）：19011998 10曲建慧，张修礼小鼠ConA性肝损伤模型J世界华人消化 20

23、01，9（5）：571574杂志，11邓利娟，李湛军，罗楹，等Caspase抑制剂F1013对刀豆蛋白A J中国药理学通报，2012，28诱导小鼠急性肝损伤的治疗作用 （1）：136139 肝细胞坏死 +500032030011112 429745936279887 150333122700101 031000012100010 平均秩次43.20* 117.9072.3582.3566.0071.4570.45*68.2592.10114.0057.69*59.05*65.0066.9059.55 * 正常组3模型组0WEl0WEm0WEh0PEl PEm0PEh0EEl0EEm0EEh1BEl0BEm2BEh0GLX2P值 * 57.9350.000 41.7510.000 P0.001，注：*P0.05/14，与模型组比较。 ConA诱导肝损伤