辛伐他汀、阿托伐他汀对脑缺血再灌注大鼠血清mda、sod及脑组织nos表达的影响

1、遵义医学院届硕士学位论文他汀类药物对大鼠脑缺血再灌注后等的影响材料和方法一实验材料实验动物大鼠只，雌性，体重，购于第三军医大学野战医院动物研究所，清洁级，动物中心许可证号：渝实动设旌准第号。饲养条件：室温，相对湿度一，每日光照维持，昼夜循环，饲以蛋白质含量为的标准饲料块，自由饮水，分笼饲养。主要试剂辛伐他汀片阿托伐他汀钙片试剂盒检测试剂盒检测试剂盒液多聚赖氨酸其他生化试剂主要仪器及设备分光光度计电子天平台式高速离心机海南海灵制药厂有限公司北京红惠生物制药股份有限公司福建福州迈新生物科技公司购自南京建成生物科技公司购自南京建成生物科技公司武汉公司武汉博士德公司产品均为国产分析纯上海生化仪器厂北京

2、赛多利斯电子有限公司产品，低温冰箱 德国光学显微镜微波炉（）显微照相机重庆光学仪器厂日本 日本公司二实验方法实验分组大鼠适应性喂养，经筛选，只大鼠按抓取的随机分为组：假手术组（），辛伐他汀预处理组（，其又分为高剂量组和低剂量组），阿托伐他汀预处理组（，亦又分为高剂量组和低剂量组），缺血再灌注组（组），每组只。术中出血较多、出现呼吸困难、遵义医学院届硕士学位论文他汀类药物对大鼠脑缺血再灌注后等的影响取脑时发现蛛网膜下腔出血及提前死亡者剔除，并补足相应例数。给药方法辛伐他汀和阿托伐他汀小剂量组均以计算，用生理盐水配成浑悬液，大剂量组均以计算，用生理盐水配成珊，根据计算的量以灌胃针灌胃，每天一次，共

3、天。假手术组与组均以等量生理盐水灌胃。药物剂量的计算根据动物实验方法学中公式：（“） ，给药时闯以血药浓度达稳定为依据。动物模型制作方法参照法并予改良制作大鼠脑缺血再灌注模型（）线栓的制备：将真径日本鱼线拉直固定于板上，放入考箱中加热使之变直。并将鱼线剪成长的短线若干。其前端用聚乙烯醇浸泡后风干，在距聚乙烯醇端处标记，放入生理盐水中备用。（）缺血再灌注模型的制备：用水合氯醛（）腹腔注射麻醉大鼠，仰卧固定于手术板上，沿颈部正中切开皮肤，分离显露左侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，分离迷走神经后用手术线结扎颈总动脉近心端、颈外动脉。用大鼠动脉夹铗闭颈内动脉，颈总动脉分叉处穿线备用，在颈总动脉上两线之

4、闻用眼科手术剪剪一小缺口，将鱼线涂有聚乙烯醇端由缺口插入颈总动脉和颈内动脉，松开动脉夹，将鱼线插入颅内，插入深度为（插入线之远端离颈动脉分叉处的距离）。结扎颈总动脉分叉处，缝合皮肤。后再灌注时提拉鱼线至有阻力时止，长度约为。假手术组插入线栓的长度为，其余步骤同模型组。神经功能评分术后约动物苏醒。按评分标准【评分：级（分）：无神经功能障碍；级（分）：提大鼠尾，见瘫痪侧前肢回收屈曲不能正常伸向地面：级（分）：除了级体征外，向瘫痪侧推时感阻力较对侧明显降低；级（分）：除了以上体征外，大鼠爬行时向瘫痪侧旋转（追尾现象）。假手术组无神经功能障碍（分）。缺血组分或分以上者入选本实验。标本采集及制作各组分别

5、于缺血再灌注，用水合氯醛按再遵义医学院届硕士学位论文他汀类药物对大鼠脑缺血再灌注后等的影响次麻醉大鼠，开胸暴露心脏，分离升主动脉，穿线备用，经右心室穿刺取血，分离留取血清于口低温冰箱保存，待检测和。取血后立即经升主动脉快速灌注生理盐水，剪开左右心耳（同时钳夹胸主动脉），直至右心房流出液清亮为止。然后用多聚甲醛（的磷酸盐缓冲液配制）灌注固定，断头取脑。冠状切取视交叉后部脑组织，将大脑置于甲醛中固定。染色和免疫组织化学染色冠状切取大脑视交叉后部位组织，常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，制成厚的脑组织切片，进行染色，封片，光镜下观察病灶区组织病理变化。另制成厚的脑组织切片粘于多聚赖氨酸处理后的

6、玻片上，室温保存备用。进行免疫组织化学染色。检测方法：（）和检测方法：化学比色法，采用硫代巴比妥酸法测定血清中的含量；采用黄嘌呤氧化酶法测（）。试剂均采用南京建成生物工程研究所的试剂盒。操作步骤严格按照说明书进行。仪器采用上海产型分光光度计。全部数据输入计算机进行统计学处理。（）免疫组织化学染色法：切片脱蜡、水化，：室温分钟灭活内源性酶，蒸馏水洗涤次；滴加正常血清封闭液，室温分钟，甩去余液；不同的切片分别适量加入即用型羊抗大鼠、抗体，湿盒内过夜。滴加生物素化山羊抗鼠， 分钟；然后滴加链霉亲合素一生物素一过氧化氢酶复合物 分钟。除加入正常血清封闭液外，以上各步间均用（）充分洗涤。最后用显色，常规

7、脱水、透明、封片。用已知阳性切片作为阳性对照，替代一抗作为阴性对照。图象处理：采用图象处理系统，每组大鼠各取一张免疫组化切片，每张随机取个视野，分别分析、和的光密度值并计算表达的面密度和的阳性细胞百分率。取平均值作为统计参数。三统计学分析所有数据以均数加减标准差（曲表示，各参数的比较采用单因素方差分析，两组间比较采用检验。全部数据采用软件包进行统计、遵义医学院届硕士学位论文他汀类药物对大鼠脑缺血再灌注后等的影响学处理，以差异有显著性，为有差异极显著性。实验结果一各组大鼠脑组织病理学改变光镜下假手术组大鼠皮层各层细胞排列整齐，神经元结构完整；模型组染色见脑组织坏死明显，白质内小血管周围有大量淋巴

8、细胞、巨噬细胞等炎性细胞浸润。组和组坏死面积较模型组小，白质内小血管周围有少量淋巴细胞、巨噬细胞等炎性细胞浸润（见图）。图假手术组大鼠脑组织图 组大鼠脑组织染色（）染色（） （） （）图细胞排列整齐神经元结构完整。图 预处理组大鼠脑组织染色（）图细胞大量缺失坏死，有广泛的炎性细胞浸润。图 预处理组大鼠脑组织染色（） （） （）图显示梗死范围较小，坏死较组轻，内可见炎性细胞浸润。图可见小片状坏死及少量的炎性细胞浸润。二各组大鼠外周血浓度和浓度见表遵义医学院届硕士学位论文他汀类药物对大鼠脑缺血再灌注后等的影响表各组大鼠外周血（“）、浓度（ （）（组别（）（）；分析结果显示，缺血后浓度均下降，组下降

9、最为显著（氏髓口），与组相比较预处理组可以显著提高血清浓度，降低含量（彻，其中，和两组（氏现），差异有极显著性。各预处理组之间相比较，无明显差异（）。三各组大鼠脑组织、和的表达表各组大鼠脑组织的表达 见表氏 光密度和面密度均显示各预处理组表达较明显降低（），在各预处理组之间差异无显著性（）。从上可以看出假手术组没有表达，缺血再灌注损伤后其表达显著性增加，辛伐他汀和阿托伐他汀可显著下调的表达。表各组大鼠脑组织的表达遵义医学院届硬士学位论文他汀类药物对大鼠脑缺血再灌注后等的影响 ，光密度和阳性细胞百分率分析显示，在假手术组有少量表达，缺血再灌注后其表达显著性增加（）。与组相比，辛伐他汀和阿托伐他汀

10、预处理可显著下调，差异有显著性伊口口，）。辛伐他汀和阿托伐他汀组之间及高低剂量组之闻差异无显著性（）。表各组大鼠脑组织的表达（光密度） 组别。土。；在的表达中，组增加不明显，；其余各组表达均显著增加（）：、表达较组显著增加俨）；较组上调具有明显的显著性差异伊口）；较上调不明显，。在、和各组之间，较上调明显俨口影，余各组之间无明显差异性俨口）。各组、和的免疫组化表达情况可参见图图。遵义医学院届硕士学位论文图假手术组的表达 图显示组织及内皮细胞中无表达图组的表达 图血管内皮及神经细胞黄染，他汀类药物对大鼠脑缺血再灌注后等的影响图 组的表达 图血管内皮细胞、神经元及神经胶质细胞及炎性细胞表达显著增加

11、。图 组的表达 图仅见血管内皮细胞少许黄染但着色较组浅。遵义医学院届硕士学位论文图假手术组的表达 图图中只有个神经元细胞被染成棕黄色。图组的表达 图显示黄染的神经元细胞着色稍浅，阳性细胞百分数较组少 他汀类药物对大鼠脑缺血再灌注后等的影响图 组的表达 图显示大量的神经元细胞黄染，且着色深。图 组的表达 图显示黄染的神经元细胞着色浅阳性细胞百分数较组少。遵义医学院届硕士学位论文图假手术组的表达 图显示在血管内皮有少量的表达（轻微黄染）。图组的表达 图显示血管内皮及神经元大量深度黄染，表达显著性上调。他汀类药物对大鼠脑缺血再灌注后等的影响图 组的表达 图内皮细胞染色较假手术组明显且染色血管数目增多

12、。图 组的表达 溉珊图血管内皮及神经元亦见有大量深度黄染，表达显著性上调遵义医学院届硬士学位论文讨他汀类药物对大鼠瞎缺血再灌注后等的影响论急性缺血性脑血管病是严重威胁人类健康、致残和致死的主要疾病，积极预防和早期有效治疗至关重要。急性缺血性卒中的治疗主要通过两个途径：一是溶解血栓，恢复脑血液循环；二是神经保护治疗，阻止缺血及缺血后再灌注所引起的脑组织一系列病理及生化反应，防止神经元死亡。人体正常代谢产生的自由基可被体内相应的自由基清除酶如超氧化物歧化酶（）等及时清除，使自由基产生与清除之间处于动态平衡，脑缺血再灌注时可通过黄嘌呤氧化酶、线粒体系统、自细胞系统、一氧化氮合成酶系统等使氧自由基（）

13、大量产生，同时自由基防御系统功能受损，活性下降，动态平衡被破坏，。自由基具有很高的化学活性，可通过自由基连锁反应造成膜损伤、线粒体功能障碍、溶酶体破裂、细胞溶解和组织水肿等一系列损害，引起细胞凋亡和坏死，造成组织细胞损伤。还可诱导脂质过氧化、蛋白质氧化和直接损伤核酸而引起神经元和内皮细胞损伤，】。因此自由基损害机制是缺血再灌注损伤中的重要环节，而是歧化超氧阴离子的专一性酶，是体内重要的抗氧化酶系统，其活性高低可反应体内抗自由基水平，对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，保护机体免受损伤】。增强的功能可起到神经保护的作用。是脂质过氧化物反应的最终产物，含量间接反应了自由基水平和组织受损伤的

14、程度【，。他汀类药物是一羟基一一甲基戊二酸单酰辅酶（ ，）还原酶抑制剂，是一类强效降胆固醇药物。在以往的研究中，显示他汀类药可能通过多种途径、多种机制发挥抗氧化，保护缺血脑组织、挽救缺血半暗带【引。本研究结果显示，阿托伐他汀和辛伐他汀均可以提高浓度，降低浓度，说明阿托伐他汀和辛伐他汀可通过保护酶浓度而具有抗氧化作用，减少脂质过氧化物的生成。由于本实验对象所采用的是正常血脂大鼠，且给药时间短，仅以达稳定血药浓度为标准，所以阿托伐他汀和辛伐他汀这种抗氧化酶浓度保护作用不能用其降脂作用来解释，是独立于调脂外功能。与本研究结果相仿的是等 】一项关于辛伐他汀和多效性的对照研究，他们发现服用辛伐他汀治疗周

15、，降低程度没有明显区别，但辛伐他遵义医学院届硕士学位论文他汀类药物对大鼠脑缺血再灌注后等的影响汀组浓度明显增加。一氧化氮（）是以耩氨酸为底物在一氧化氮合酶（）催化作用下形成的一种生物活性分子，正常浓度时起信号传递作用，高浓度时则产生细胞毒性作用，引起细胞死亡。在脑缺血损伤中的作用可能具有双重性，既可以通过扩张血管维持脑血流【】，防止血小板和白细胞的聚集与粘附及下调受体而起到神经保护作用，另外一方面，参与了兴奋性毒性作用，在脑缺血时，可介导皮层、海马神经元谷氨酸（）神经毒作用【。按功能不同，可分为结构型（）和诱导型（）。受细胞内浓度的调节，其又可分为内皮细胞型（）和神经元型（）定位于血管内皮细胞

16、，其产生的具有协调内皮细胞的旁分泌自身稳定功能，包括抑制细胞和血小板黏附，控制血管张力，维持血流与血管壁间的抗血栓界面，通过增加脑局部血流保护脑组织。对神经元损伤发挥重要保护作用。在生理条件下即具活性，故属“生理状态”酶。在脑缺血早期以表达为主，故表现为脑保护作用。世纪年代中期利用转基因老鼠研究和在脑缺血中的作用捕】，这类实验表明在模型中，剔除基因的小鼠与野生鼠相比，前者梗死体积明显大于后者。广泛分布于中枢神经系统神经元，如大脑皮质的外锥体细胞、层的多极神经元、尾壳核神经元、海马区中间神经元等【】。在脑缺血缺氧和外伤时大脑皮质和海马神经元细胞异位表达，能够引起皮质神经元凋亡与坏死，】。敲除基因

17、小鼠海马神经元不仅能耐受氧和葡萄糖剥夺后的缺氧损伤，也能抵抗谷氨酸引起的兴奋性神经毒，其缺血再灌注损伤后脑水肿的程度也大大减轻，脑梗死灶的面积大大减小：应用的抑制剂如、可减少脑缺血后大脑皮质的梗死面积，降低脑梗塞所致的神经元死亡率，也能明显提高海马区神经元抗缺血缺氧损伤的能力，。这些研究均表明升高可引起神经损伤，下调对神经系统可以起到保护作用。是一种非依赖性的酶，定位于炎性细胞、神经胶质细胞、神经元及血管平滑肌细胞，生理状态条件下不表达，而在病理条件下如脑塞苎匡兰堕墅星堡主兰垡望塞丝翌茎蔓塑塾丕曼燮生墨篓望星婪堕曼塑璧堕缺血或再灌注后才持续激活诱导表达，故属“病理状态”酶】。等测得在脑缺血再灌

18、宿酶活性和蛋白水平于再灌注后开始出现，达到峰值，开始下降。在缺血晚期神经损伤中起着很重要的作用。在缺血中后期（后）主要以表达为主，诱导产生大量聚集在缺血脑组织中并通过坏死与凋亡介导细胞死亡，。国外研究使用同源重组技术，获得型基因敲除小鼠，发现及基因敲除小鼠在后梗死灶减小，说明及在脑缺血后的表达具有毒性作用，】。目前、和已成为缺血性脑卒中防治研究的新热点。本研究结果显示，在正常脑组织中有少量和表达，不表达：缺血再灌注损伤后，、和表达均增加，说明损伤可诱导的合成，与前面研究相符。研究中，阿托伐他汀和辛伐他汀可显著上调大鼠缺血脑组织中，且可显著抑制和的表达。表明他汀类药物可以通过抑制、的表达和增强的

19、表达，具有神经保护作用。且这种作用亦独立于其调脂作用之外。和等通过实验研究显示他汀类药物可以上调，减少神经损伤结果相似。由此可见，他汀类药可通过抗氧化和调节协同作用，减轻缺血脑组织细胞的损害。这种协同作用的机制可能是通过上调，改善脑组织血管内皮功能及血液循环，以及下调、，从而避免的毒性作用，减少其与超氧阴离子相互作用所产生的过氧化反应损伤。临床常用的他汀类药物有：普伐他汀、洛伐他汀，阿托伐他汀和辛伐他汀等，具有安全性高，耐受性好的特点。阿托伐他汀和辛伐他汀为脂溶性还原酶抑制剂，在调脂研究中显示阿托伐他汀作用最强。本实验通过对比研究显示，和两者之间在抗氧化性及对的表达方面差异无显著性；在两者的高

20、、低剂量组之间，高剂量组作用比低剂量组有显著性的趋势，但两者之间无显著的统计学意义。高、低剂量之间无显著差异的原因可能与剂量分组较少，且低剂量起步低，高、低剂量之差距不大有关。其剂量与效应的关系尚需要通过实验与大量的临床进一步探讨。本实验结果是通过他汀药物预处理大鼠所取得的，这为临床前瞻性研遵义医学院届硕士学位论文他汀类药物对大鼠脑缺血再灌注后等的影响究所显示的结果一一他汀类药能减少卒中的发病率及改善其预后提供了一个佐证。等采用胆固醇正常的大鼠经预先服用辛伐他汀天或天后缝线结扎大鼠的大脑中动脉。发现辛伐他汀能够降低脑梗死的面积。其实验与本研究一起可以显示他汀类药物运用子预防脑卒中的益处，然而众

21、多的患者是在卒中后才入院的，至于他汀类药在卒中后的治疗上能否有效改善神经功能达到预期的效果，我们将作进一步的临床与实验研究。结论、与缺血再灌注比较，和均可增加大鼠脑缺血再灌注后血清浓度，降低浓度，具有抗氧化作用。、和可以上调大鼠脑缺血再灌注后脑组织表达，降低和表达，具有直接的神经保护作用。、对大鼠脑缺血再灌注后、和表达的影响，和相比较，差异无显著性。、对上述指标的影响，高、低剂量组间及高、低剂量组问差异无显著性。遵义医学院届硕士学位论文他汀类药籽对大鼠黯缺血再灌注后等的影响参考文献， ，：， ，（）： ，： ，（）： ， ，：， ，：孙敬方，动物实验方法学人民卫生出版社，： ， ， ， ；（）

22、：，： ， ： ， ；： ， ， ，；：“ ， ， ： ，遵义医学院嘶届硕士学位论文他汀类药物对大鼠脑缺血再灌注后等的影响， ；：， ， ：， （）：谢坤，李勇他汀类药物的多效性研究，世界缶床药物，（）： ， ，；： ， ，；（）： ： ， ： ，；： ，；： ， ，（）： ，（）： ， ：， ，（）：， ， ； ，（）： ， ， ， ， 遵义医学院届硕士学位论文他汀类药物对大鼠脑缺血再灌注后等的影响 ， ，（）：， ： ；：邓强，徐浇，朱东驱，诱生型一氧化氮合酶与局灶性脑缺血后期缺血生命科学，（）： ， ， ， ，（）：， ，（）：，（） ，：遵义医学院届碗士学位论文他汀类药物对大鼠脑缺血再

23、灌注后￥等的影响文献综述他汀类药物与缺血性脑血管疾病的研究进展袁胜山综述前张骏余昌胤审校言他汀类药物（），即羟基甲基戊二酸单酰辅酶（ ，）还原酶抑制剂，是一类强效降胆固醇药物，具有安全性高，耐受性好等优点。为治疗高胆固醇血症取得了突破性进展，使脂质革命进入了。他汀”时代：自年第一个他汀类药物一美伐他汀问世及年洛伐他汀作为调胎药物上市以来，在世晃范围内对他汀类药物进行了广泛的研究。究阮结果证明该类药物除能明显调节血脂外，还具有多向性抗动脉粥样硬化作用，能显著降低冠心病及卒中的发病率，减少心、脑血管事件的发生率；在心、脑血管疾病的防治方面有着广泛的作用。尤其是其血管神经保护功能为广大幅床及实验研究

24、工作者关注的热点。本文就他汀类药物在缺血性脑血管疾病防治方面的研究综述如下：他汀类药物对卒中的预防作用近十年来，一系列观察他汀类药物对脑卒中危险性影响的临床试验表明，他汀类药物可显著减少缺血性卒中的发病，其在脑卒中的防治中具有良好的临床效益。主要临床试验有：、和，研究共观察例患者，他汀类药物治疗组脑卒中的发生率为与对照组（）相比，他汀类药物可使脑卒中的危险性下降川。他汀类药物不但可以减少脑卒中的发生，而且还可以改善脑卒中患者的临床预后。最近的动物研究发现，胆固醇正常的大鼠经预先服用辛伐他汀或后缝线结扎大鼠的大脑中动脉，发现辛伐他汀能够降低脑梗死的面积口】。脑卒中后服用他汀类药物可以通过血管、神

25、经和突触的再生诱导脑细胞重建，减少损伤范围，该作用和血中胆固醇水平无关，停止他汀类药物天后上述保护作用消失。研究发现，发病前已开始他汀类药物治疗的脑卒中病人住院时间缩短。在第届美国神经病学年会上，遵义医学院届硕士学位论文他汀类药物对大鼠脑缺血再灌注后等的影响麻省大学的 博士报告了他们最新的结果认为急性缺血性卒中后服用他汀类药物与个月后的转归改善有关。其结果非常有意义；且不能用基线评分的微小差异来解释。他们按是否服用过他汀类药物将患者分成卒中前服用过、卒中后周内开始服用和未服用过组。然后采用回归分析法，分别评价周时每组评分或评分下降至少分和评分高于分的病例数。结果发现，卒中后服用他汀类药物与主要转归（评分下降至少分）改善有关（），评价次要转归时发现，卒中后服用他汀类药物是转归改善，即评分下降至