qPCR实验步骤_第1页
qPCR实验步骤_第2页
qPCR实验步骤_第3页
全文预览已结束

下载本文档

版权说明：本文档由用户提供并上传，收益归属内容提供方，若内容存在侵权，请进行举报或认领

文档简介

1、Q-PCR实验流程一、 总RNA抽提1)细胞培养皿中细胞样品用1X PBS洗两次后，用1ml枪将PBS吸干净，加入1ml Trizol (invitrogen)溶液，吹打混匀，并吸至1.5ml RNase free EP管中使细胞充分裂解，室温静置5min;组织样品用液氮充分研磨，加入1ml Trizol (Invitrogen)溶液，混匀，室温放置5min使其充分裂解;(管盖与管壁都需标记样品名称)2)加入200l氯仿（5X），剧烈振荡混匀1min，使水相和有机相充分接触，室温静置3-5min;(离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序排好，与第一步的顺序一致)3) 4下，14

2、000g离心5min，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNase free EP管;(用20-200ul的枪吸取上清，吸上清时，枪头应沿着液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层)4)沉淀RNA：加入等体积（1:1）异丙醇，轻柔地充分混匀(颠倒6-8次)(不应用振荡器混匀)，室温静置10min;5)4下，14000g离心15min，收集RNA沉淀(如离心后仍不见EP管底部有沉淀，应将EP管放置在-80度冰箱过夜，继续在4下，14000g离心10min，收集RNA沉淀)，去上清;6)用75%乙醇洗涤两次，12000g离心5min(加入乙醇后只需轻轻颠倒EP管即可，不用振荡器震荡或

3、枪头吸打沉淀)，弃去上清液，空甩一次，以完全去除乙醇，开盖晾35min，反复2次，挥干，使样品变透明。 7)视沉淀量加入适量DEPC水(至少15ul)溶解沉淀。，打散，备用。二、反转录1) 在RNase free的PCR管中配置下列溶液.Oligd T1 ulRNA4 ulDEPC水3 ul2) 将上述溶液吹打均匀，置70保温5min，使RNA变性。随后4，保持5min， 以防止RNA复性;3) 在该PCR管中加入下列试剂（M-MLV Reverse Transcriptate）E1 uldNTP4 ulMgcl23 ulM-MLV RT 5X buffer4 ul4) 将上述20l反应溶液混

4、匀，空甩，开始反转录：25保温10min;42保温60min;70保温15min;4，。三、调cDNA浓度反转结束后，每个样品加入80 ul的超纯水，混匀，用微量分光光度计检测浓度，先用超纯水校准。20 ul（cDNA）+ 80 ul超纯水100 ul（cDNA）然后将各样品的cDNA浓度调至150 ng/ul.初始浓度 X 100 = 150 X （水 + 100） 加水量 = 初始浓度 X 100/150 100.四、PCR:20 ul 体系酶E10 ul模版2 ul引物2.5 ul水5.5 ul离心甩匀后，放入PCR扩增器中，设置反应体系。五电泳 配胶：1.5% 80 ml 1 X TBE + 1.2 g 琼脂微波3 min，使之澄清，加入8 ul Gelred摇匀（与TBE 1:10000），加入板上，

人人文库> 全部分类> 教育资料 > 中学教育

温馨提示

  • 1. 本站所有资源如无特殊说明，都需要本地电脑安装OFFICE2007和PDF阅读器。图纸软件为CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
  • 2. 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等，如果需要附件，请联系上传者。文件的所有权益归上传用户所有。
  • 3. 本站RAR压缩包中若带图纸，网页内容里面会有图纸预览，若没有图纸预览就没有图纸。
  • 4. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
  • 5. 人人文库网仅提供信息存储空间，仅对用户上传内容的表现方式做保护处理，对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑，并不能对任何下载内容负责。
  • 6. 下载文件中如有侵权或不适当内容，请与我们联系，我们立即纠正。
  • 7. 本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。

最新文档

评论

0/150

提交评论