植物细胞工程重点

1、绪论：生物技术：以生命科学为基础，利用生物体系和工程学原理，生产生物制品和创造新物种的一种综合技术。植物细胞工程：指在植物细胞水平上进行的遗传操作。植物细胞工程就是应用植物细胞生物学和分子生物学的理论和技术，在细胞水平上离体培养或遗传操作，以达到快速繁殖、改良品种或生产更多更好的植物产品的工程学科。植物细胞工程的内容研究植物器官、组织、细胞在离体培养时需要的有机营养、无机营养、植物激素、温度、湿度、光照等环境条件以及发育阶段和基因等的遗传操作。植物细胞工程内容可分为：器官培养，胚胎培养，组织培养，原生质体培养。延伸内容：植物脱毒培养、突变体筛选、细胞杂交、超低温冷冻储藏和人工种子等。植物细胞的

2、全能性：每个植物细胞在适合条件下具有发育成完整植物个体的潜在能力。原理：生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因。（1） 受精卵的全能性最高（2） 受精卵分化后的细胞中，体细胞的全能性比生殖细胞的低。分化：细胞在形态、结构和功能上发生永久性的适度变化的过程。脱分化：有高度分化能力的组织或器官产生愈伤组织的过程。再分化：脱分化后的细胞再次分裂、分化并形成不同组织、进而构成器官和植株的过程。愈伤组织：当将离体组织或器官放在培养基上进行离体培养事，这样离体组织或器官就会进行细胞分裂，形成一种高度液泡化的呈无定形的薄壁细胞，称为愈伤组织。外植体：指用于

3、植物培养的接种材料，包括植物体的各种器官、组织、细胞和原生质体等植物培养条件：基本培养基、适宜的植物激素 、适宜的温度 空气、无菌环境、适合的pH 、适时光照等。胚状体: 指植物细胞、组织或器官的离体培养中，起始于一个非合子细胞，并经过胚胎发育过程分化出的类似胚一样的细胞群。胚状体产生的四种方式：1.直接在器官上发生、2.培养物先形成愈伤组织，再由愈伤组织分化成胚状体、3.在花药培养中，由小孢子发育成胚状体、4.在单细胞和原生质体培养中，先由细胞行程一个胚性细胞团，再由胚性细胞团上的细胞发育成胚状体诱导胚状体途径的优点：1数量多2.速度快3.结构完整植物细胞工程的应用：1.快速繁殖2.快速繁殖

4、实现工厂化育苗 特点：繁殖快，性状稳定，整齐一致，无病虫害，周期短，周年生产。3.种苗脱毒（茎尖培养可以得到无病毒苗木）4.细胞育种 (1) 利用培养变异，筛选优良突变体(2) 利用细胞融合技术，克服远缘杂交不亲和性。4.药用植物的工厂化生产第一章：实验室设计：应选择采光好、通风好、环境干净的地点，以利于培养的顺利进行和降低培养过程的污染率。植物组织培养的实验室，通常包括通用实验室，接种室，恒温培养室，检查培养情况并做记录的细胞学实验室。对玻璃器皿要求：1.耐腐蚀；耐高温、高压 2.透明度好；3.便于接种。第二章：培养基的成分：1.无机营养物（无机盐）2.碳源和能源3.维生素类4.氨基酸及有机

5、附加物（氨基酸、维生素、肌醇、天然复合物）5.植物生长调节物质6.琼脂7.活性炭无机营养物（无机盐）：大量元素 C H O N P S K CA Mg Cl微量元素 Fe Mn B Zn Mo Cu CoN：蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分，在植物生命活动中占有重要的位置。满足培养物对氮的需求，胚胎发生所需要的元素之一 P：磷脂的主要成分，参与植物生命活动中核酸以及蛋白质合成、光合作用、呼吸作用以及能量储存、转化与释放等重要的生理过程 K：对碳水化合物合成、转移、以及氮素代谢等有密切关系。Mg、S、Ca：叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂，对核蛋白体结构具有稳定作用；

6、S：含S氨基酸的蛋白质的组成成分。Ca：构成细胞壁的成分，对细胞分裂，稳定质膜结构有显著作用，此外，Ca及钙调素在细胞信号转导中起重要作用。铁：氧化酶的组成成分，又是叶绿素形成的必要条件。硼：与蛋白质合成、糖类运输有着密切的关系；铜：某些氧化酶的成分，能够促进离体根的生长；锰：与植物的光合、呼吸代谢；钼：参与氮素的代谢；氯：光合作用水光解的活化剂。VB1: 促愈伤组织产生，提高活力VB6: 促根生长Vpp（烟酸）: 与代谢和胚发育有关Vc: 防组织褐变肌醇：促进愈伤组织生长、胚状体和芽的形成，对组织细胞繁殖、分化的促进作用天然复合物：提供一些必要的微量营养成分、生理活性物质和生长激素等碳源和能

7、源：主要是蔗糖、葡萄糖。作为离体组织赖以生长的碳源，使培养基维持一定的渗透压 植物生长调节物质：1.生长素类 种类：IBA吲哚丁酸；IAA吲哚乙酸；NAA萘乙酸；2,4-D-2,4-二氯苯氧乙酸。作用诱导愈伤组织和根分化，促进细胞分裂和伸长。 配制 生长素可溶解在稀NaOH中或溶于乙醇。2.细胞分裂素类（CTK）种类：6-BA-苄氨基腺嘌呤、Kt-激动素、2-iP-异戊烯腺嘌呤、ZT-玉米素、TDZ 作用：促进细胞的分裂和器官的分化，延缓组织的衰老，增强蛋白质的合成，一直顶端优势，促进侧芽的生长及显著改变其他的激素作用。生长素/细胞分裂素：高：有利于根的形成和愈伤组织的形成；适中：有利于根芽的

8、分化；低：有利于芽的形成赤霉素：促茎伸长，促胚发育成植株；打破休眠；一般在器官形成后加入。琼脂：固化作用活性炭：吸附作用，利于某些植物生根，有利于胚胎培养抗生素：抑制内生菌抗氧化物：防止氧化配制培养基母液时要用蒸馏水或重蒸馏水，以保持母液及培养基成分的精确性，防止贮藏过程发霉变质。药品：应选取等级较高的化学纯（CP）或分析纯(AR)母液（贮备液，stock solution)配制的目的：1）方便配制其他培养基；2）保证各物质成分的准确性及配制时的快速移取3）便于低温保藏。 母可分别配成大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素类等。母液配制方法：（1）单配法：将培养基配方中的各种成分分别配成一定浓

9、度的母液。（2）混配法：将几类营养成分按配方中的用量扩大一定倍数称量，分别溶解后每一类混合在一起定容到一定体积配成混合母液.培养基的种类：根据其态相不同分为固体培养基和液体培养基 ，根据培养物的培养过程分为初代培养基和继代培养基，根据其作用不同分为诱导培养基、增殖培养基、生根培养基，根据其营养水平不同分为基本培养基和完全培养基。第三章茎尖是最好的部位：形态已基本形成，生长速度快，遗传性稳定，也是获得无病毒苗的重要途径外植体选择的原则：1.培养材料的来源是否保证2.是否会引起不良变异。3.叶片的来源最有保证，许多植物的组织培养以叶片为外植体。4.对一些培养较困难的植物，利用子叶或下胚轴取材季节：

10、在生长开始的季节取材，若在生长末期或已进入休眠时取样，则外植体可能对诱导反应迟钝或无反应。器官的生理状态和发育年龄：1.通常年幼组织比年老组织有较高的形态发生能力，容易培养，有较大的再生能力。2.植物上部器官的生长时间虽短，其生理年龄却较老。而越向基部，则生理年龄越小。3.上部组织容易形成花器官,下部组织越易形成营养器官。选取适宜大小：材料太大易污染；材料太小，难于成活。外植体的灭菌方法预处理：先对植物组织修整，去掉不需要的部分，流水中冲洗干净。70%的酒精中约30s，用0.1%的升汞（HgCl2）中浸泡5-10min，无菌蒸馏水冲洗35次污染是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致

11、培养失败的现象。第四章：接种：把经过表面消毒后的植物材料切碎或分离出器官、组织、细胞，并将它们转到无菌培养基上的全部操作过程。注意接种操作，防止污染 ，分布均匀（外植体必须与培养基紧密接触，在培养容器内均匀分布，以保证营养的充分利用，以及光照条件均匀一致 ），注意对象：1. 种子和分生组织：培养时通常将其贴放在培养基表面，而不是插到培养基内部，以免供氧不足。2. 接种茎段：注意形态学下端插入培养基内，而形态学上端露于空气中3. 接种带腋芽的茎段：将茎段平放在培养基上，可破除顶端优势，有利腋芽生长。培养方法：固体培养和液体培养。固体培养：优点: 简单，应用广泛。缺点: 1.外植体或愈伤组织只有底

12、部表面接触培养基、吸收养分，造成各部分营养浓度差异，影响生长。2.外植体插入培养基后，气体交换不畅及排泄物质积累，影响组织吸收和造成毒害。3.受光不均匀，生长不一致。液体培养：分静止培养和振荡培养（连续浸没，定期浸没）静止液体培养优点：1.培养基中不出现营养物浓度差异的现象，用来进行许多营养方面的研究工作。2.静止培养不需增添专门设备，适合于某些原生质体培养；振荡液体培养：(1) 连续浸没：搅动或振动培养液使组织悬浮于培养基中。培养液的体积约占容器体积的20 ，以确保最大的气相表面，造成较好的通气条件。 （2）定期浸没：组织块时而在液体中时而在气体里，这样既可保证培养基的充分混和，又保证了组织

13、块呼吸所需的气体交换。外植体的培养条件：光照、温度、湿度、氧气和培养基的pH值、气体等褐变：是指外植体在培养过程，自身组织从表面向培养基释放出褐色物质，以致培养基逐渐变成褐色，外植体也随之变褐而死亡的现象。褐变的原因1.褐变与外植体组织中所含的酚类化合物和多酚氧化酶有关。2.通常酚类化合物和多酚氧化酶分隔存在，比较稳定。3.当切割外植体后，切口附近的分隔作用破坏，酚类与多酚氧酶接触，酚类迅速氧化成褐色的醌类物质和水，4.醌类又会在酪氨酸酶等的作用下，与体内的蛋白质发生聚合，进一步引起其他酶系统失活，从而导致代谢紊乱，生长停滞，最终衰老死亡。防止褐变的措施：1.温度过高或光照过强，诱导多酚氧化酶

14、的活性提高，从而加速外植体的褐变。2.液体培养基可有效克服外植体褐变。原理：在液体培养基中，外植体溢出的有毒物质可以很快扩散，因而对外植体造成的伤害较轻。3.培养基中无机盐浓度过高，酚类物质将会大量外溢。4.黑暗条件下，生长调节物质的存在会影响褐变。细胞分裂素6-BA或KT不仅能促进酚类化合物的合成，而且还能刺激多酚氧化酶的活性。生长素类如2，4-D和IAA可延缓酚类化合物的合成，减轻褐变现象发生。5.加抗氧化剂6.加吸附剂、活性炭6. 培养基的pH值较低时，可降低多酚氧化酶活性和底物利用率，从而抑制褐变。外植体的玻璃化：指组培苗出现的一种生理失调或生理病变，叶、嫩梢呈水晶透明或半透明、发生异

15、常的现象。玻璃化的危害性：由于其组织畸形，吸收养料与光合器官功能不全，分化能力大大降低，因而很难继续用作继代培养和扩大繁殖的材料；加上生根困难，很难移栽成活。 预防玻璃化的措施：1）适当提高培养基中蔗糖和琼脂的浓度 2）适当降低细胞分裂素和赤霉素的浓度3）适当控制培养基中无机营养成分 4）增加自然光照，控制光照时间5）控制好温度 6）改善培养器皿的气体交换状况 7）在培养基中添加其它物质 第五章：愈伤组织的形成：从外植体脱分化形成典型的愈伤组织大致可分为三个时期：起始期，分裂期，形成期。起始期：1.细胞准备进行分裂的时期。2.外植体的细胞处在静止状态。3.刺激因素(如机械损伤、改变光照强度、增

16、加氧等)和激素的诱导作用，使外植体细胞的合成代谢活动加强，蛋白质和核酸的合成, 诱导细胞开始分裂。分裂期:外植体细胞经过诱导以后脱分化，不断分裂增生子细胞的过程。细胞的主要表现：1.外层细胞在外源激素的作用下，迅速分裂，使得外层细胞数目增加，2.细胞体积缩小，细胞的核和核仁增大到最大。逐步回到分生组织状态。3.随着细胞不断分裂和生长，细胞总干重、蛋白质和核酸量大大增加，新细胞壁合成极快。细胞分裂快，结构疏松，缺少有组织的结构，维持其不分化的状态，颜色浅而透明。形成期：指在分裂期的末期，细胞内开始出现一系列形态和生理上的变化，从而使愈伤组织内产生不同形态和功能的细胞。细胞特点：1.细胞分裂部位和

17、方向发生改变：内部细胞发生分裂，形成像维管束或类似分生组织，组成的鸟巢状结构。2.细胞的体积相对稳定，不再减少。3.出现了各种类型的细胞：如管胞、纤维细胞、薄壁细胞、分生细胞、色素细胞等。4.生长旺盛的愈伤组织呈乳白色、白色或浅绿色，老化的多转化为黄色或褐色。愈伤组织生长周期：愈伤组织生长周期为24周。1.在培养基上生长一段时间以后，由于营养物质枯竭，水分散失，或有毒代谢物的积累，导致愈伤组织停止生长，甚至老化变黑、死亡。2.转移到新鲜培养基：定期地将它们分成小块，接种到新鲜的培养基上，可以长期保持旺盛的生长。影响愈伤组织形成的主要因素（1）不同植物和外植体诱导愈伤组织能力的差异。（2）培养基

18、种类对愈伤组织诱导的影响。（3）外源激素对愈伤组织诱导的影响-重要因素。（4）培养条件对愈伤组织诱导的影响: 湿度条件、温度条件、光照条件。愈伤组织中的形态发生方式：愈伤组织器官发生和通过体细胞胚胎/胚状体途径再生植株愈伤组织器官发生：1.先不定芽，在茎基部长根2.先长根 后长芽3.在不同部位分别形成根和芽影响愈伤组织器官发生的因素：（1）外植体自身因素（内因）母体植株的遗传基础 外植体的类型（2）植物激素的作用（外因）：适宜的植物激素配比在器官分化中有着重要的作用。生长素/细胞分裂素体细胞胚发生途径：胚状体/体细胞胚（embryoid） ：指植物细胞、组织或器官的离体培养中，起始于一个非合子

19、细胞，并经过胚胎发育过程分化出的类似胚一样的细胞群。体细胞胚的产生方式1）直接在器官上发生2） 悬浮培养细胞发生途径3）愈伤组织发生途径 : 幼胚、胚和子叶4）单细胞发生途径：花药培养中的小孢子发育成4）原生质体发生途径体细胞胚状体诱导的影响因素1）生长素2）其他植物生长物质的作用3）氨源形态的影响4）其他培养条件对胚状体发生的影响体细胞胚途径再生植物的优点：1）数量比不定芽多2）获得速度快3）结构完整4）胚状体可制成人工种子，便于运输和保存；5）胚状体的有性后代遗传性更接近母体植株。人工种子：人工种子是指外面包裹一层有机薄膜的植物胚状体。胚状体或芽：有生命的物质结构。人工胚乳：供胚状体维持生

20、命力。人工种皮：保护作用。人工种子的优点：1）结构完整，体积小，便于贮藏与运输，可直接播种，易于机械化操作；2）不受季节限制，不受环境制约，胚状体数量多、繁殖快、有利于工厂化生产；3) 有利于繁殖生育周期长、自交不亲合、珍贵稀有的一些植物，也可大量繁殖无病毒材料；4) 加入抗生素、农药、菌肥等成分，提高人工种子活力和品质；5) 由无性繁殖体系产生胚， 固定杂种优势。 局限性： 1.人工种皮尚不尽如人意，贮藏困难 2.生产成本高 3.流程复杂第六章：营养器官培养：主要指植物根、叶、茎、花、果实等器官在离体条件下，在无菌的人工环境种做进一步培养发育，最终长成幼苗的过程。特点：能保持它们所具有的特征

21、性结构，通过器官培养可快速大量地繁殖。离体根的无性系: 由单个直根衍生，并经继代培养而保持遗传性一致的根的培养物。根培养的意义:v 1) 进行根系生理、代谢研究的最优良实验体系;v 2) 研究器官分化、形态建成的良好体系；v 3)可建立快速生长的根无性系。茎的培养分为茎尖培养和茎段培养茎段培养: 指带有腋（侧）芽或叶柄、长数厘米的茎节段进行离体培养。植物生长调节剂的影响 u 植物生长抑制剂三碘苯甲酸促进嫩茎增殖。u 6-BA 1-3mg/L促进茎增殖有效，浓度高会减少茎的伸长，也对下一步生根起抑制作用。u 赤霉素抑制月季茎的增殖。茎培养的意义：v 无性系快速繁殖；v 培养无病毒苗，品种改良；v

22、 理论基础研究。叶的培养：很多植物的叶片具有很强的再生能力，由于取材方便，数量多且均一性较强，可以作为适宜的外植体。叶培养的意义：1）研究叶形态建成、光合作用、叶绿素形成的好方法2）通过叶组织的脱分化与再分化证实叶细胞的全能性3）通过叶组织培养，探索离体叶组织培养的条件和影响因素4）建立体细胞快速无性繁殖体系5）叶细胞培养物经诱变筛选突变体。第七章植物离体快速无性繁殖: 利用离体培养技术,用优良植株的外植体进行培养,在短期内获得大量遗传一致的个体的方法;所获得的株群称单株无性系或单芽无性系。与传统无性繁殖方式的区别:繁殖速度快，不受自然的干扰，使育苗工厂化。植物快繁的类型与器官形成方式：1 不

23、定芽型2 器官型3 器官发生型4 胚状体发生型5 原球茎发生型不定芽型：诱导顶端分生组织产生不定芽，再生成植株的方式。特点：1.繁殖率高2.利用外植体原有的芽，包括隐芽在内繁殖数量大，3.能保持物种遗传稳定性。器官型：从器官外植体诱导不定芽，再生成植株的方式。特点：遗传稳定性较好， 但繁殖速度慢。器官发生型：从器官外植体诱导愈伤组织，经愈伤组织细胞的分化再生成植株的方式。器官发生型的特点：1. 繁殖速度快，2.由于经愈伤组织而再生成植株，遗传稳定性较差。胚状体发生型：由植物器官、组织和细胞培养而直接发生胚状体，最后以胚状体成苗的方式。胚状体发生型的特点：n 遗传稳定性一致，n 部分植物体细胞发

24、生数量相当大。兰球茎型大：部分兰花属于这一类型。原球茎是兰花种子萌发时产生的呈珠粒状、缩短的、类似嫩茎的器官。继代培养：是初代培养之后的连续数代的扩繁殖培养过程。继代培养过程中会产生两两种现象，即驯化现象和衰退现象驯化（acclimation）: 在开始继代培养需要加入生长调节物质，其后加入少量或不加入生长调节物质就可以生长的现象。原理：继代培养中细胞积累了较多的生长物质，因此逐渐减少对外源生长物质的需要。衰退(recession) : 长期培养的材料也会逐渐衰退，丧失形态发生能力，表现为生长不良，再生能力和增殖率下降等。分化能力衰退的机理：1）愈伤组织中含有从外植体启动分裂时就包括进来的成器

25、官中心（分生组织），当重复继代会逐渐减少或丧失，影响形成维管束，只能保持无组织的细胞团。2）继代培养过程中，逐渐消耗了原有的与器官形成有关的特殊物质。3）内源生长调节物质的减少或丧失。4）细胞染色体出现畸变，数目增加或丢失 。影响继代培养的因素：（1）植物材料的影响 （2）培养基及培养条件 （3）继代培养时间长短（4）季节的影响植物脱毒方法：物理方法，化学方法，生物方法物理方法：（一）高温处理又称温热疗法某些病毒受热以后不稳定，失去活性（1） 温汤浸渍处理 （2）热风处理 热处理的局限性1.并非所有的病毒都对热处理敏感。只对等径、线状的病毒和类菌质体起作用。2.延长热处理时间，病毒钝化效果好，

26、同时也可能会钝化植物组织中的抗性因子而降低处理效果。3.影响植株存活。（二）低温处理，亦称冷疗法。化学方法：化学处理，又称化学疗法。一些化学药品如嘌呤和嘧啶类似物、氨基酸、抗生素处理，可抑制植物体内或离体叶片内病毒的合成，但仍不能使病毒失活。 生物学方法：茎尖培养微体嫁接脱毒愈伤组织脱毒珠心胚培养脱毒花药培养脱毒为什么茎尖培养能够除去病毒？1.病毒的移动2条途径：2.一是通过维管系统，而分生组织中尚未形成维管系统；二是通过胞间连丝，但这条途径病毒移动速度非常慢，赶不上茎尖和根尖细胞不断分裂和活跃的生长速度。微体嫁接脱毒：小茎尖（0.141.0mm）嫁接到无病毒的试管实生苗砧木，培育在培养基上，

27、可获得无病毒的幼苗愈伤组织脱毒：感染病毒的愈伤组织细胞并非全部含有病毒。原因：可能因为细胞增殖速度快过病毒复制速度，或者细胞产生变异，获得对病毒感染的抗性，最终表现出脱毒现象。缺陷：后代变异的几率大；有的愈伤组织不能分化成苗。珠心胚培养脱毒：珠心胚：柑橘类多胚品种中除一个受精胚以外，尚有多个由珠心细胞形成的无性胚；原理：珠心胚与维管束系统无联系，因此由珠心胚产生的植株全部均无病毒。珠心胚大多是不育的，必须分离培养才能发育成正常的幼苗。花药培养脱毒：花药培养获得单倍体植物，经染色体加倍后即为无病毒植株。脱毒植物鉴定：鉴定原因：1.脱毒率非常低，有时无毒株只占千分之几。2.病毒具有延迟的恢复期，所

28、以在最初18个月中每隔一定时间仍需进行鉴定。鉴定方法：直接测定法、指示植物法、抗血清鉴定法、酶联免疫吸附法、电子显微镜检查法、免疫吸附电镜法。脱毒苗在生产中的应用：脱毒苗用于生产可以明显提高产量和质量，一般产量可提高30以上。 无病毒苗的长期保存：在培养基中加生长延缓剂，低温保存，超低温保存第八章花粉是花粉母细胞（小孢子母细胞）经过减数分裂而形成的，因此，花粉是单倍体的生殖细胞。单倍体细胞(haploid cell)：植物的花粉是花粉母细胞经减数分裂形成的，其染色体数目只有体细胞的一半。花粉和花药的培养(pollen and anther culture)是指花粉在培养基上改变其正常发育和机能

29、，不经受精而发生细胞分裂，由单个花粉粒发育成完整植株的技术。单倍体植物(haplobiont)：用离体培养花药的方法使花粉发育成一个完整的植株。花药培养：是将花粉发育至一定阶段的花药接种到人工培养基上进行培养，以形成花粉胚或愈伤组织进而分化成植株的技术。花粉培养：是将花粉从花药中分离出来进行离体培养的过程。花药制备与培养取材要求：小孢子发育时期在单核晚期。注意：1.防止损伤花药：操作过程中注意不要损伤花药，不要直接夹花药，若受损伤，则应淘汰。因为损伤常常会刺激花粉壁形成二倍体的愈伤组织。2.去掉花丝：为了去掉体细胞单倍体植株的二倍化：自发加倍 优点：不会出现核畸变，缺点：加倍频率极低；人工加倍

30、用秋水仙碱处理单倍体可使加倍频率提高 从愈伤组织再生把单倍体植株的茎、叶柄或根的节段，诱导形成愈伤组织，把这种愈伤组织转移到分化培养基上，在再生植株中将出现许多二倍体植株。子房培养：子房培养是指将子房从母体上分离出来，在无菌的人工环境条件下培养，使其生长发育形成幼苗的过程。分为授粉子房培养和为授粉子房培养未授粉子房性细胞（卵细胞、助细胞、极核、反足细胞）-胚状体或愈伤组织-雌性单倍体植株体细胞（珠被、子房壁）-胚状体或愈伤组织-二倍体植株；受粉子房：获得成熟果实或者具有生活力的种子胚珠培养：分为受精胚珠的培养和未受精胚珠培养受精胚珠：一是形成种子；二是形成愈伤组织未受精胚珠：形成单倍体植株子房

31、胚珠的培养应用1. 挽救杂种胚，促进原胚继续生长，使杂种幼胚发育成熟；2. 未授粉胚珠和子房，诱导孤雌生殖，产生雌性单倍体离体受精：从花粉萌发到受精形成种子，从种子萌发到幼苗形成的整个过程，均在试管内完成，称为离体受精，或试管受精离体受精：子房试管受粉：人工方法把花粉直接引入子房，使花粉粒在子房腔内萌发并完成受精过程。精卵细胞融合法：微电融合、高钙高PH介导融合、一般钙条件下融合、PEG诱导融合离体受精的意义：1.离体受精技术在克服自交不亲和性与远缘杂交障碍，特别是克服花粉在柱头上不萌发或萌发后不能进入花柱，或在花柱中生长缓慢，使配子不能如期融合方面有着极其重要的意义。2.另外，试管受精技术也

32、为外源特异基因的有性转移，诱导遗传变异开辟了一条新途径胚培养：采用人工的方法将胚从种子、子房或胚珠中分离出来，再放在无菌的条件下，让其进一步生长发育，以至形成幼苗的过程。胚培养的意义： 用于胚的挽救，促使发育不良或中途败育的胚发育成熟 打破种子休眠,缩短育种周期,抢救储藏过久或储藏不当的种子 克服珠心胚的干扰 (多胚性植物柑橘、芒果、蒲桃、仙人掌） 诱导胚状体及胚性愈伤组织 种子生活力的快速测定 胚乳培养：将胚乳从母体上分离出来，放在无菌的人工环境条件下，让其进一步生长发育，以至形成幼苗的过程胚乳培养的应用 1）胚乳培养可得到三倍体植株，产生无籽果实。或加倍形成六倍体植株进行育种。 2）胚乳培

33、养可得到倍性不同的愈伤组织，可分离和筛选各种类型的非整倍体植株。第九章单细胞的分离：机械法、酶解法、从愈伤组织分离单细胞机械法：特点：细胞不会受到酶的伤害；不需质壁分离，有利于进行生理和系列化研究。局限性：只有薄壁组织排列松散，细胞间结触点很少时, 用机械法分离叶肉细胞才能取得成功。酶解法：用果胶酶、纤维素酶处理，分离出具有代谢活性的细胞；特点：不仅能降解中胶层，而且还能软化细胞壁。用酶切法时，必须对细胞给予渗透压保护。从愈伤组织分离单细胞：愈伤组织细胞之间的结构松散，高频率振动获得单细胞或酶解。细胞悬浮培养：即植物细胞或小的细胞聚集体在液体培养基中于摇床上进行悬浮培养特点：1) 细胞可以不断

34、增殖，形成高密度的细胞群体，适于大规模培养；2) 能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。植物细胞培养的特性： 比微生物细胞大得多 有纤维素细胞壁，细胞耐拉不耐扭，抵抗剪切力差； 生长速度缓慢，操作周期长。 易受微生物污染，需用抗生素； 细胞生长期易凝聚为大的团块，悬浮培养较难； 培养时需供氧，培养液粘度大： 因为有细胞壁, 培养细胞产物滞留于细胞内，产量较低； 细胞有全能性, 易分化, 导致目的产物低于原植物体内浓度； 悬浮培养中要求有一定的细胞浓度，否则不生长（2.55*104个/ml）。细胞悬浮培养分为分批培养和连续培养分批培养（Batch culture） ：

35、指细胞在一定容积的培养基中进行培养。在培养过程中，除了气体和挥发性代谢产物可以同外界交换外，一切都是密闭的。当培养基中的主要营养物质耗尽时，细胞的分裂和生长即行停止。连续培养：利用特别的培养容器进行大规模细胞培养的一种培养方式。连续培养过程中，不断注入新鲜培养基。排掉等体积的旧培养基，不断补充营养物质。培养的细胞生长速率相对一致，形成一个稳定状态的培养。悬浮培养的影响因子： 悬浮培养物分散性良好，细胞团较小； 均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同； 生长迅速。细胞悬浮培养主要应用： 生产植物有用代谢产物 诱发和筛选突变体 原生质体培养和细胞分离单细胞培养的方法主要有三种：看护培养技术、平板培

36、养技术、微室培养技术 看护培养：用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，使其持续分裂和增殖的一种培养方法。优点：简便、成功率高。缺点：不能在显微镜下直接观察。平板培养：将单个细胞与融化的琼脂培养基均匀混合，并平铺一薄层在培养皿底上的培养方法特点：定点定期观察；单细胞无性增殖系；培养细胞气体交换不畅。植板效率：用平板法培养单细胞时，常以植板效率表示能长出细胞团的细胞占接种细胞总数的百分数，求算公式为：每个平板上形成的细胞团数/该平板上接种的细胞数微室培养技术：将细胞培养在很少量的培养基中用途：主要用来观察细胞生长、分裂、分化，形成细胞团的过程。特点：培养基用量少，营养水分不足，pH变幅大，细胞仅

37、能短期分裂影响单细胞培养的因子：培养基的成分 初始植板细胞密度 材料 光照 pH CO2第十章植物产生次生代谢产物的类型：苷类、甾醇、生物碱、醌类、蛋白质类细胞培养是获得代谢产物的最有效途径植物细胞途径获得代谢产物的优势： 1) 细胞培养的全过程都能有效地得以控制，不受地理环境、病虫害和季节等因素的影响，可以保证产物无限、连续、均匀地生产。 2) 在实验室较快地进行细胞的筛选和培养条件的优化而获得超过原植株含量的细胞和培养条件。影响植物细胞大量培养的因素：培养基组分、光照、pH值、温度、代谢调控因子、接种量、通气状况和气体组成、两相培养基第十一章原生质体：指用特殊方法脱去植物细胞壁的、裸露的、

38、有生活力的原生质团。没有细胞壁，但具有活细胞的一切特征。原生质体培养：指将植物细胞游离成原生质体，在适宜的培养条件下，依据细胞的全能性使其再生细胞壁，进行细胞的分裂分化，并发育成完整植株的过程。原生质体培养的用途：n 作为一个良好的实验系统，应用于植物细胞骨架、细胞壁的形成与功能、细胞膜的结构与功能、细胞分化与脱分化等重大理论问题的研究。n 作为植物生物技术的一个重要分支，应用于外源基因转移、体细胞杂交、无性系变异及突变筛选。n 无细胞壁障碍，便于遗传操作；n 具有全能性n 易于诱导融合形成杂种细胞用于原生质体培养的化学试剂有：1.无机化学试剂，2.有机化学试剂：维生素、激素、渗透压稳定剂、碳

39、源和氮源。3.凝胶剂酶类：纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶外植体的选择 ：u 选择生长旺盛的植物体幼嫩部分。u 多数植物以叶肉细胞，根、下胚轴、幼叶、子叶等，温室植株较好。u 植物的年龄、季节、光照、肥水条件等都明显影响原生质体的质量。对数生长早期的细胞1.预处理: 暗处理、低温处理或预先在培养基上进行预培养。2.外植体灭菌。3.酶解处理：黑暗、静止，振荡，以促进酶解。温度2527。4.原生质体的收集和纯化：过滤离心法：飘浮法：常用的飘浮剂：蔗糖、Percoll、Ficoll。沉淀法：甘露醇5.活力测定：1) 形态识别：形态 完整，含饱满的细胞质，有胞质环流，颜色新鲜的即为存活的原生质体。2) 染

40、色识别 ：0.1%酚番红或伊凡蓝染色,有活力而质膜完整的原生质体对染料有排斥作用而不被染色，死亡的却被染上颜色。影响原生质体活力的因素：1分离材料的生理状态2.酶解条件：酶质量、浓度、酶解温度、酶解时间、酶溶液的渗透压3.分离条件：离心次数、离心速度、纯化方法、分离持续时间4.环境条件：操作环境的温度、分离用具的影响 原生质体培养方法：液体培养、固体培养、固液混合培养原生质体植株再生的途径：一种途径是将原生质体再生的愈伤组织直接转移到分化培养基上。另一种是先将愈伤组织培养在含细胞分裂素和低浓度2，4D的分化培养基上，行程之地较硬的胚性愈伤组织或胚状体，在将其转到含有细胞分裂素的分化培养基上再生

41、植株。原生质体融合：也叫做体细胞杂交，是以原生质体培养技术为基础，借用动物细胞融合方法发展和完善的一门新型生物技术，是以体细胞为材料，通过物理、化学因子的诱导进行融合，得到杂种细胞的过程。体细胞融合的意义n 细胞融合不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，避开生殖细胞的受精过程，在亲缘更远的物种间实现基因转移，创造出自然界中所没有的新物种。n 含有双亲核外遗传系统的杂种细胞在分裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组，从而产生新的核外遗传系统。细胞融合的方法：n 自发融合：去壁的裸细胞具有彼此融合的能力，在酶解细胞壁过程中，有些原生质体能彼此融合形成同核体; n 诱导融合：不同来

42、源的原生质体细胞用 物理和化学的方法诱导使之融合的过程。1） 物理方法-电融合 2） 化学方法：优点：操作方便，不需要价格昂贵的仪器。NaNO3处理。高pH值高钙处理、PEG处理PEG优点：1.融合频率高 2.重复性强 3.对大多数细胞低毒 4.诱发融合无特异性5.广泛应用 细胞融合的程序： 两种亲本的原生质体分离 用理化因子诱导融合 异核体或杂种细胞的选择 杂种细胞的培养及再生 杂种细胞的鉴定等。融合类型： 同核体：同源原生质体的融合体; 如： A-A，B-B以及 A-A-A，B-B-B等多聚体。 异核体：非同源原生质体的融合体; 如： A-B 多核体：含有双亲不同比例核物质的融合体。异核体或杂种细胞的选择方法：遗传互补筛选法、抗性互补筛选法、利用物理特性筛选法、利用生长特性筛选法原生质体用于研究细胞生理反应n 研究细胞生理反应、细胞壁合成、细胞分裂与分化的机理n 研究细胞信号转导途径。原生质体作为基因转化系统n 电激法、显微注射法、脂质体、PEG、农杆菌介导法的转化对象。n 电激法基本原理: 高压电脉冲作用使原