[讨论]内标法与外标法的应用.doc

1、 讨论 内标法与外标法的应用内标法： 选择适当的物质作为内标物质， 定量加入被测样品中， 跟据被测组分和内标物质的峰面积之比，乘以校正因子，对映内标物质加入量所进行含量测定方法。内标法的优点：色谱条件对结果影响不大，准确度、精度较高；缺点：选择合适的内标物质比教困难。外标法：又称标准曲线法，依照测量标准品所绘制的曲线来计量被测样品的含量的方法。外标法的优点：简单，适和大量样品分析。缺点：每次色谱条件很难相同，容易出现误差。请问大家在做含量测定时依照什么原则来选定方法的？我们一般作体外药物分析时均采用外标法，体内药物分析， 因提取步骤烦琐，都采用内标法进行校正， 但如果仪器稳定、方法的重现性好，

2、也可使用外标法， 国外体内药物分析用外标法的也有不少，但本人认为最好使用内标法。实际样品检测用外标法的更多。原因：1. 内标物难获得，特别是同位素标记的有相近行为的内标物；2. 操作步骤多、计算烦琐如在新药报批中使用内标物， 则需报送内标物的结构确证资料， 在报生产的同时还要报送此内标物对照品。所以现在连 SDA的专家都不推荐使用内标法。最初使用内标是因为进样器进样不准确，采用内标可以校正进样误差。现在的HPLC用定量环进样准确度很高，加了内标有时候因为操作的误差反而降低准确度。在药物质量检验中，如果是原料药， 或者制剂的成份不很多， 用外标法即可， 不一定非要用内标法，而且现在越来越多的标准

3、都放弃了用内标法。对于体内药物分析， 分析方法的误差反而不是那么的重要， 而在样品处理的过程中引入的误差要引起足够的重视，所以，一般在处理过程中加入内标以校正误差。 这个时候， 回收率的高低又不是绝对的要求很高，虽然要求绝对回收率在 70%或者 80%以上，但是，有时候低一些也无所谓，关键是回收率的稳定性，测定的重现性。欢迎行家指点： ）-却是如此，我刚刚做完体内药物分析，内标法却是比较麻烦-个人认为体内分析应该用内标法，否则结果不准确。-但药典中一些原料药和制剂用的还是内标法-一般内标法能够消除进样量不准造成的系统误差， 在采用自动进样器的前提下， 这两种方法的精密度差别并不大。 但是，建立

4、内标法色谱条件明显要麻烦些， 所以在采用自动进样器的仪器上，尽可以采用外标法进行测定。药典中采用内标法进行测定的往往是一些老的品种，现在一般的趋势是采用外标法测定。实际上，内标法中需要对两个色谱峰进行积分同样也会引起误差增大的-体内药物分析， 特别是需要提取步骤的，加入内标可消除提取过程带来的偶然误差，内标一定要在提取前加入到样品中并要混合均匀后再加入提取液， 如此操作使提取的系统误差大大降低。内标物的结构及化学性质一定要与目的物相似。-很同意 inferno的观点， 内标法与外标法各有千秋，我正在做体内成分的测定，因内标物与代测成分是在是分不开，再加上我的样品处理方法比较简单，所以就采用了外

5、标标准曲线法。-我支持啊我支持啊我支持啊我支持啊我支持啊我支持啊我支持啊我支持啊我支持啊我支持啊我支持啊我支持啊我支持啊我支持啊我支持啊我支持啊我支持啊我支持啊我支持啊我支持啊我支持啊我支持啊我支持啊我支持啊我支持-很受用 谢谢！-各位老师，外标法需要注意什么啊-内标有它的优点， 可寻找合适的内标物比较困难， 特别是在没有已有文献时， 能不用内标就不用内标，尽量先优化制样方法。-总结的很好，我主要用液相做西药的含量测定，都是用外标法，操作很简单，容易。去年还做了一个人体生物等效性试验， 用液 - 质联用法， 内标法。 试验中发现内标和外标的不同情况应用，感觉当仪器响应变化很大时，必须选用内标法

6、，否则测定就没有意义了。-我谈谈我的看法 :内标法是以前针对仪器的不稳定和进样的误差较大而设定的, 其在克服仪器 , 环境因素方面有独到之处 , 但对于找到合适内标物仍是较大难题. 这不用我多说 . 但对于现在仪器条件, 有时内标不如外标 , 我从方法准确方面谈谈我的看法 .在用外标法做含量测定时, 药典采用多种限制条件来控制方法误差,如系统适应性 , 控制供试与对照浓度的差异范围等. 系统适应性用来判定仪器能否达到稳定要求, 一半 waters和agllent 的连续进样误差在1%以内 , 自动进样就更不用说了. 达到要求时 , 其仪器部件特别是件测器表明已稳定 , 可以进样 . 通过控制供

7、试与对照浓度的差异范围是通过减少标准曲线不完全过圆点造成的方法误差 .1. 一般外标法的步骤为对照供试各2 份,每份2 针 , 取平均计算. 其误差为 (4*0.2%(称量 )+4*0.2%( 稀 释 )+2%( 仪器 )*4)/2=4.8%.内 标 法 为 两 份 各 一 针 , 其 误 差 为2*0.2%( 称量)+2*0.2%( 一次稀释 )+0.2%( 转移 )+0.2%( 二次稀释 )+2*2%( 仪器 )=5.2%, 如果仪器误差很小或在 1%以内时 , 可以看出内标对外标的相对误差要大. 内标相对外标还有一次内标物的转移和稀释所多造成的人为误差, 且无法通过重复取平均来消除. 其

8、人为因素影响占较大成分. 在仪器高度发达的今天, 仪器的误差已经在人为误差之下. 所以其为准确度不如外标的主要原因.2. 在测定含量时 , 内标法还有内标物与供试杂质或杂峰重叠的风险 , 此时内标定量也不如外标准确 .3. 做体内药分时 , 在处理前加内标 , 也存在内标物与血桨结合 , 萃取损失等缺点 , 且同样与待测物一样 , 重复性不佳 , 也无法保证每次处理内标与待测物的回收比率一致 , 这时就不如外标的实迹值准确 , 因为在定方法时 , 其可能损失已经有回收率应大于 . 这个指标来控制 .4. 单个误差比较 . 在选取色谱条件时 ( 尤其是气相 ), 其很多参数是依据待测物来定 ,

9、在制定其检测条件时 , 其待测物的耐受性一般是要验证的 , 以保证其个人 , 仪器 , 实验室间的误差 , 在此条件下 , 其方法对于内标物, 其耐受性一般均不会优于待测物, 即其在仪器变化的影响, 内标大于待测物 , 其内标就不如外标方法稳定.我做气相时就经常因温度对内标的挥发和聚集不利而导致校正因子误差很大, 所以评判时要看其使用的对象, 具体问题具体分析.以上是个人愚见, 欢迎指正 !下载文档收藏归一化法、外标法、内标法的区别分析化学分析化学隐藏色 谱 定 量 方 法 一、归一化法 由于组分的量与其峰面积成正比，如果样品中所有组分都能产生信号， 得到相应的色谱峰， 那么可以用如下归一化公

10、式计算各组分的含量。 (7.34)若样品中各组分的校正因子相近，可将校正因子消去，直接用峰面积归一化进行计算。中国药典用不加校正因子的面积归一化法测定药物中各杂质及杂质的总量限度。(7.35)归一化法的优点是： 简便、 准确、定量结果与进样量重复性无关 ( 在色谱柱不超载的范围内) 、操作条件略有变化时对结果影响较小。缺点 是：必须所有组分在一个分析周期内都流出色谱柱，而且检测器对它们都产生信号。不适于微量杂质的含量测定。 二、外标法用待测组分的纯品作对照物质，以对照物质和样品中待测组分的响应信号相比较进行定量的方法称为外标法。 此法 可分为工作曲线法及外标一点法等。工作曲线法是用对照物质配制

11、一系列浓度的对照品溶液确定工作曲线，求出斜率、截距。在完全相同的条件下，准确进样与对照品溶液相同体积的样品溶液， 根据待测组分的信号， 从标准曲线上查出其浓度， 或用回归方程计算，工作曲线法也可以用外标二点法代替。通常截距应为零，若不等于零说明存在系统误差。 工 作曲线的截距为零时，可用外标一点法 ( 直接比较法 ) 定量。 外标一点法是用一种浓度的对照品溶液对比测定样品溶液中 i 组分的含量。将对照品溶液与样品溶液在相同条件下多次进样， 测得峰面积的平均值， 用下式计算样品中i组分的量：WA(W) (A) (7.36)式中 W 与 A 分别代表在样品溶液进样体积中所含i 组分的重量及相应的峰

12、面积。 (W )及 (A) 分别代表在对照品溶液进样体积中含纯品i组分的重量及相应峰面积。外标法方法简便，不需用校正因子，不论样品中其他组分是否出峰，均可对待测组分定量。但此法的准确性受进样重复性和实验条件稳定性的影响。此外，为了降低外标一点 法的实验误差， 应尽量使配制的对照品溶液的浓度与样品中组分的浓度相近。 三、内标法 选择样品中不含有的纯物质作为对照物质加入待测样品溶液中，以待测组分和对照物质的响应信号对比，测定待测组分含量的方法称为内标法。“内标” 的由来是因为标准( 对 照 ) 物质加入到样品中，有别于外标法。该对照物质称为内标物。 在一个分析周期内不是所有组分都能流出色谱柱( 如

13、有 难气化组分 ) ，或检测器不能对每个组分都产生信号，或只需 测定混合物中某几个组分的含量时，可采用内标法。准确称量 W 克样品，再准确称量 W 克内标物， 加入至 样品中，混匀，进样。测量待测组分i 的峰面积 A 及内标物 的峰面积 A ，则 i组分在 W 克样品中所含的重量 W ，与内标物的重量 W ，有下述关系：(7.37) 待测组分 i在样品中的百分含量 C为： (7.38)对内标物的要求；内标物是原样品中不含有的组分，否则会使峰重叠而无法准确测量内标物的峰面积；内标物的保留时间应与待测组分相近，但彼此能完全分离(R 1.5) ； 内标物必须是纯度合乎要求的纯物质。 内标法的优点是： 在进样量不超限( 色谱柱不