《食品酶学第三章》ppt课件

1、第三章 酶的分别和纯化技术 本章重点v各种分别方法的操作原理v分别方法的运用原那么v酶分别纯化中应留意的问题酶天然酶人工改造酶动物植物微生物粗酶精制酶冻干酶粉 溶液态酶化学的生物的固定化酶化学修饰酶抗体酶基因工程酶 处理问题？如何提高酶的回收率和纯度质量 Purpose？获得一定量的、不含有或少含杂质的酶制剂或者提纯为结晶，以利于在工业消费或科学研讨中运用 v建立一个可靠和快速的检测酶活与纯度的方法，并对整个分别过程中每一步一直贯穿酶活力的测定。v了解所分别酶的构造与性质特点以及酶在细胞中的存在形状。v明确原料的特性与数量。v了解各种方法的原理特性和优缺陷并选择有效的分别纯化方法。v各种方法的

2、运用顺序安排合理。v时辰防止酶的变性，操作要在温暖或低温的条件下进展。v要充分思索到介质与溶液体系中各种因子的影响和实践的实验条件。思索要素本章主要内容v第一节 酶的分别纯化程度v第二节 酶的抽提v第三节 酶溶液的浓缩v第四节 酶的分别提取v第五节 酶的纯化v第六节 酶的提纯规范表31 从 E. coli中分别、纯化天冬酰胺酶步骤总蛋白含量/mg总活力107 U 比活力/U.mg-1 回收率提纯倍数匀浆 1.410828.621001酒精粗沉淀 4.110614.3355017.540调pH4.5 9.510511.41204060上清液DEAE纤维素柱 6.51059.01403270CM纤

3、维素柱层析 3.01056.020021100结晶2.21054.822017110重结晶1.7105 3.822017110 从表31可知，随着分别、纯化过程，酶的比活力越来越高，提纯程度越来越高，其提纯倍数也越来越大，而其总活力、回收率相对降低。 普通试剂级及药品级酶纯度要求高，那么采取提纯倍数高的方法。 工业用酶对纯度要求较低，其本钱价钱显得重要，甚至有时采用粗酶液。 而食品级酶在整个分别、纯化工程中要留意卫生、防止污染，各方面均须综合思索。本章主要内容v第一节 酶的分别纯化程度v第二节 酶的抽提v第三节 酶溶液的浓缩v第四节 酶的分别提取v第五节 酶的纯化v第六节 酶的提纯规范第二节第

4、二节 酶的提取酶的提取一、酶原料的选择二、酶源资料的预处置三、酶的抽提一、酶原料的选择v1.遵照的原那么 v 酶含量多、干扰物少；来源丰富、坚持新颖；容易得到、提取工艺简单；稳定性好、平安性好；有综合利用价值等。v 例如：提取生姜蛋白酶应该以姜的根部为原料，提取淀粉酶那么应以培育的微生物为原料。 2. 留意的问题 1酶存在胞内酶和胞外酶之分，普通而言，胞内酶比胞外 酶难于提取。 2资料不同，同一资料不同部位或不同生长期，酶的含量不一样。如：脂肪氧化酶在大豆中的含量是在花生中含量的100倍。 3同一种酶在动物资料、植物资料、微生物资料中性质不同，平安性也不同。 4选择到适宜的资料后应及时运用，防

5、止酶的破坏。 5植物资料具有一些不利于酶提取的要素，如含有较高的纤维素、色素和单宁；细胞不易破碎；液泡中代谢物复杂等。 6动物脏器中含有较多的脂肪，容易氧化酸败导致原料蜕变，影响纯化操作和酶的得率。 7微生物具有种类多、繁衍快、培育简便、诱变容易和不受季节地点影响等优点，并且可以经过微生物培育方法富集诱导酶，因此已成为制备酶的主要资料之一。 8采集的资料在正式进展酶的提取之前，普通都要进展一定的前处置，去除明显可见的杂质和干扰物质。二、酶源资料的预处置胞内酶v机械破碎法v物理方法v酶解法v外表活性剂处置法v丙酮粉法机械破碎法包括研磨法和细菌磨法研磨法细菌磨法此法比研磨法省力，其破碎率也比研磨法

6、效率高。 细菌磨构造表示图物理方法超声波破碎法 浸透压法 冻融法根本原理是利用超声波10-15KHz的机械振动而使细胞破碎。由于超声波发生时的空化作用，致使液体构成部分减压引起液体内部产生很大的压力导致细胞破碎。先将细胞置于高渗溶液如蔗糖溶液中平衡一段时间后，突然将其转入到低渗缓冲液和水溶液中，细胞壁会由于浸透压的忽然变化而破碎。 将细胞在低温-15下冰冻后在在室温下溶化，如此反复多次就能使细胞壁破裂。此法也只适用于细胞壁易破的细胞。冻融过程要迅速，不能很长时间速冻速溶酶解法v 用外源的溶菌酶或细胞壁分解酶如蛋白酶、脂肪酶、核酸酶等在一定条件下作用于细胞而使细胞壁破碎。v 例如：用酶法破碎酵母

7、细胞时，需求先参与蛋白酶作用蛋白质-甘露聚糖构造；甘露糖酶可以专注的水解细胞壁上的甘露糖，使得细胞壁的构造破坏。另外再参与葡聚糖酶作用于葡聚糖层。最后改动浸透压使细胞膜破裂，胞内物质溶出。外表活性剂处置法v 在适当的温度、pH值及低离子强度下，外表活性剂如SDS、Tween、TritonX能与脂蛋白构成微泡，使膜的浸透性改动或使之溶解。v 此法对膜结合的酶的提取是相当有效的，但对其它蛋白质那么易使之变性，甚至切断肽链。丙酮粉法v 丙酮粉法的原理是利用丙酮能使细胞迅速脱水并破坏细胞壁的作用。v 详细操作：细胞离心 搜集菌体 参与冷却的丙酮液 搅拌 抽滤 反复用冷丙酮液洗涤 置枯燥器中低温保管。v

8、 经丙酮处置的细胞干粉称为丙酮粉。丙酮还能除去细胞膜部分脂肪，更利于酶的提取。三、酶的抽提 What？ 在酶的分别纯化前期，将经过处置或破坏的细胞置于一定溶液中，使被提取的目的酶与其它物质分别的过程，包括酶与细胞固体残渣的分别、酶与其他物质的分别。 酶在细胞中结合形状和溶解程度不同水溶法有机溶剂法一水溶法 大部分酶或蛋白质能溶于水、稀盐、稀酸或稀碱中，其中稀盐和缓冲液对酶稳定性好、溶解度大。 留意： 1. 盐浓度即离子强度 2. pH值 3. 温度 4. 防止蛋白酶或核酸酶的降解作用 5. 搅拌与氧化 盐浓度 绝大多数蛋白质和酶，在低离子强度的溶液中都有较大的溶解度，如在纯水中参与少量中性盐，

9、蛋白质的溶解度比在纯水时大大添加，称为“盐溶景象。 为了提高提取效率，有时需求降低或提高溶剂的极性。向水溶液中参与蔗糖或甘油可使其极性降低，添加离子强度如参与KCl、NaCl、NH4Cl或(NH4)2SO4可以添加溶液的极性。 pH值 蛋白质、酶的溶解度和稳定性与pH值有关。 过酸、过碱应尽量防止，普通控制在pH=68范围内。 提取溶剂的pH值应在蛋白质和酶的稳定范围内，通常选择偏离等电点的两侧。 温度 为防止变性和降解，制备具有活性的蛋白质和酶，提取时普通在05的低温操作。 防止酶的作用 参与抑制剂或调理提取液的pH、离子强度或极性等方法使相应的水解酶失去活性，防止它们对欲提纯的蛋白质、酶的

10、降解作用。 搅拌与氧化 v搅拌能促使被提取物的溶解，普通采用温暖搅拌为宜，速度太快容易产生大量泡沫，增大了与空气的接触面，会引起酶等物质的变性失活。v由于普通蛋白质都含有相当数量的-SH，假设提取液中有氧化剂或与空气中的氧气接触过多都会使-SH氧化为二硫键，导致酶活性的丧失。v在提取液中参与少量巯基乙醇或半胱氨酸以防止巯基氧化。二有机溶剂法v 一些和脂类结合比较结实或分子中非极性侧链较多的酶难溶于水、稀盐、稀酸或稀碱中，常用不同比例的有机溶剂进展提取。v 常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、正丁酮等，这些溶剂可以与水互溶或部分互溶，同时具有亲水性和亲脂性。 例如： 植物种子中的酶70%-80%

11、乙醇提取； 动物细胞微粒体、线粒体中存在的酶正丁醇提取，由于正丁醇亲脂性强，可提高酶的溶解度。 分配定律的定义在恒温、恒压和比较稀的浓度下，某一溶质在两个不相混合的液相中的浓度分配比是一个常数，即为下式： C1/C2恒温、恒压=K C1表示分配到达平衡后溶质在上层有机相中的浓度 C2表示分配到达平衡后溶质在下层水相中的浓度 K为分配常数，不同溶质在不同溶剂体系中有不同的K值。 从上式可知，K值越大，那么在上层有机相中溶解度越大；反之， K值越小，那么在下层水相中溶解度越大。 假设混合物中各组分k值彼此接近时，那么需求不断改换新的溶剂系统，经过多次抽提便可把各种物质分别。本章主要内容v第一节 酶

12、的分别纯化程度v第二节 酶的抽提v第三节 酶溶液的浓缩v第四节 酶的分别提取v第五节 酶的纯化v第六节 酶的提纯规范第三节 酶溶液的浓缩一、真空薄膜浓缩二、冷冻枯燥技术三、超滤技术四、透析技术 一、真空薄膜浓缩 是把酶溶液置于高度真空条件下成为薄层液膜，增大其蒸发面积到达加速蒸发过程的目的。 优点： 此法由于在真空条件下，可以大大降低热对酶分子的作用，减少其热变性失活。 例如：XJT9503高温中性蛋白酶的制备工艺：采用加热真空薄膜浓缩，在40，-0.094-0.096 MPa真空度下，经过4555min薄膜浓缩，可使发酵处置液浓缩23倍，其酶活力仅损失10%左右。二、冷冻枯燥技术v定义：冷冻

13、枯燥就是把含有大量水分的物质，预先进展降温冻结成固体。然后在真空的条件下使水蒸汽直接从固体中升华出来，而物质本身留在冻结的冰架子中，从而使得枯燥制品不失原有的固体骨架构造，坚持物料原有的形状，且制品复水性极好。v对冻干制品的质量要求是：生物活性不变、外观色泽均匀、形状丰满、构造结实、溶解速度快，剩余水分低。v冻干工艺包括预冻、升华和再干冻三个分阶段。 v适用范围：v 冰冻枯燥特别适用于那些对热敏感、易吸湿、易氧化及溶剂蒸发时易产生泡沫而引起变性的生物大分子，如蛋白质、酶、核酸、抗菌素和激素等。冷冻枯燥技术冷冻枯燥技术v本卷须知v 1.样品溶液：v 样品要溶于水，不含有机溶剂，否那么会呵斥冰点降

14、低。 v 样品要予先脱盐，不可使盐浓度过高，否那么冰冻后易融化，影响样品活性，而且不易冻干。v 样品缓冲液在冰冻时pH能够会有较大变化，此时需参与pH稳定剂，如糖类和钙离子等。 v 样品溶液的浓度不要过稀，例如蛋白质的浓度不低于15 mg/mL 为宜。 2. 装样品溶液的容器 最好用各种尺寸的培育皿盛样品溶液，液层不要太厚，以免冻干时间太长。也可以运用安培瓶和青霉素小瓶。 冻干稀溶液时会得到很轻的绒毛状固体样品，容易飞散而损失和呵斥污染，因此要用刺了孔的薄膜或吸水纸包住杯口。 3. 溶液冰冻 尽能够用干冰乙醇低温浴速冻，如能将盛有样品溶液的容器边冻边旋转构成很薄的冰冻层，那么可以大大加快冻干的

15、速度。4.冻干样品全部冻干前，不要随便摇动，以防水蒸汽冲散冻干的样品粉末。样品冻干到达较高真空度时，容器外部有时会结霜，假设外霜消逝，那么阐明样品已冻干。冻干后要及时取出样品，以免样品在室温下停留时间过长而失活。关真空泵时要先放气，以免泵油倒灌。放气时要缓慢，以免气流冲散样品干粉。样品冻干后要及时密封冷藏，以防受潮。真空泵要经常检查油面和油色，通常半年或一季度至少要换一次油。 三、超滤技术 1. 定义： 超滤过程是利用膜的筛分机理，在加压条件下，把酶溶液经过一层只允许水分子和小分子物质选择性透过的微孔超滤膜，而酶等大分子那么被截留，从而到达浓缩酶液的目的。 超滤膜是具有特定的均匀孔径和孔隙的多

16、孔薄膜。 表3-2 “Diaflo 超滤膜的物理特性膜代号 截留酶的分子质量/U 近似平均孔径/nm XM-300300 00014XM-100100 0005.5XM-5050 0003PM-3030 0002.2PM-2020 0001.8PM-10100001.5UM-210001.2UM-0.5 50012. 超滤膜的资料 醋酸纤维素、各种芳香聚酰胺、聚砜和聚丙烯腈-聚氯乙烯共聚物。 3. 超滤膜主要方式 折叠平板式、管壳式、螺旋式和中空纤维管式 四种主要超滤膜(1) 折叠平板式 (2) 管壳式 (3)螺旋式 (4)中空纤维管式 1. 折叠平板式膜可制成平面滤板，板内构成折叠以添加过滤

17、面积，提高液流的湍动程度，降低浓差极化，此型式安装构造简单，膜面积可达1500m2，易于清洗，易改换，其缺陷是过滤面积的扩展会遭到限制。 2. 管壳式超滤安装是使待处置的酶溶液在管内流动，溶剂及低分子溶质透过管壁会聚后排出。 3. 螺旋式 主要安装是螺旋卷，是将膜、支撑资料、膜、间隔资料依次迭好，围绕一中心管卷紧，构成一个膜组，料液在膜外表经过间隔资料，沿轴向流动，使待处置酶液在管内错流呈螺旋道路。 4.中空纤维管式 目前常用的是中空纤维超滤膜。内径为0.5-1mm左右，酶溶液从管内流过，溶剂和低分子溶质可透过管壁集中后流出。这种安装过滤面积大，过滤面积高达3000m2/m3。 表3-3 中空

18、纤维超滤安装特性型号 25SIP-3013HF53-20-PM10 HF30-20-PM10HF15-43-PM10中空纤维内径/mm0.80.50.51.1公司分析相对分子质量6000100001000010000超滤器外径/mm890760760760超滤器长度/mm11921092635635超滤有效面积/m24.74.92.81.4允许使用压强/Mpa3.02.71.752.7最高使用温度/80757575持液量/ml 625340405SIP为旭化成公司产品，运用细胞色素C为规范物；而HF为Amicon公司产品，运用白蛋白为规范物。四、透析技术 透析是利用半透膜的选择性在溶液里分别大

19、分子和小分子的一种分别技术。 经常用于除去蛋白或核酸样品中的盐、变性剂、复原剂之类的小分子杂质。 样品在膜的一边，缓冲液在另一边，小分子即向两边分散直到平衡，而大分子那么由于半透膜的阻拦而留在一端，经过不断改换缓冲液，即可将样品中要除掉的小分子稀释到足够低的浓度。本章主要内容v第一节 酶的分别纯化程度v第二节 酶的抽提v第三节 酶溶液的浓缩v第四节 酶的分别提取v第五节 酶的纯化v第六节 酶的提纯规范一、胞外酶蛋白酶为例的分别提取工艺流程发酵液冷却（5）搅拌罐离心分离菌体沉渣（300kg）下一步提纯浓缩液超滤废液处理处理废液超滤清液（189m3）（洗涤液50m3）浓缩液（49m3）（200m3

20、，酶活力2000U/ml）50m3水，洗涤三次处理( 10m3)蛋白质的分别提纯工艺流程 二、胞内酶酰胺酶的分别提纯工艺流程发酵液离心研磨破碎细胞悬浮液搅拌槽错流过滤器滤渣超滤滤液下一步提纯搅拌槽(5m3/h，酶活18U/ml)(玻璃珠)(7m3)(7.5m3)(水3.5m3，重复3次)(3.5m3)(30m3)(2m3)(1.9m3,酶活414U/ml)酰胺酶的分别提取工艺流程图三、木瓜蛋白酶的提取工艺 木瓜蛋白酶是利用未成熟的番木瓜果实表皮的白色乳汁，提炼而成的一种蛋白水解酶。它是由212个aa组成，分子量为21000，属于含巯基-SH肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性。 已被广泛运用于食

21、品、美容化装品、医药保健品、饲料等多个行业。 未成熟番木瓜人工取乳液参与抗氧化剂过滤陈杂压滤下一步提纯(120目钢质筛)。本章主要内容v第一节 酶的分别纯化程度v第二节 酶的抽提v第三节 酶溶液的浓缩v第四节 酶的分别提取v第五节 酶的纯化v第六节 酶的提纯规范第五节 酶的纯化一、根据酶溶解度不同的纯化方法二、根据酶分子大小、外形不同的纯化方法三、根据酶分子电荷性质的纯化方法四、根据酶分子专注性结合的纯化方法 一、根据溶解度不同方法沉淀法 定义溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。 根本原理是根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而到达分别的目的，不同溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之

22、间亲和力的差别而引起的，溶解度的大小与溶质和溶剂的化学性质及构造有关。在酶制备中最常用的几种沉淀方法：1. 盐析法 2. 有机溶剂沉淀3. 选择性沉淀4. 等电点沉淀5. 有机聚合物沉淀盐析法1定义 在溶液中参与中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析 。2优点 本钱低，不需求特别昂贵的设备。 操作简单、平安。 对许多生物活性物质具有稳定作用。 3盐析法沉淀蛋白质的根本原理 蛋白质和酶均易溶于水，由于该分子的COOH、NH2和OH都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用构成水化层，包围于蛋白质分子周围构成1nm100nm颗粒的亲水胶体，减弱了蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子外表极性基团越

23、多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因此溶解度也越大。 亲水胶体在水中的稳定要素有两个：即电荷和水膜。 中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以参与大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴显露疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即构成沉淀。4中性盐的选择 常用的中性盐中最重要的是NH42SO4。 优点： 1) 溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其他盐类所不具备的。2) 分别效果好：有的提取液参与适量硫酸铵盐析，一步就可以除去75的杂蛋白，纯度提高了4倍。 3) 不易引起变性，有稳定酶与蛋白质构造的作用。 4) 价钱廉价，废液不污染环境。

24、5枯草杆菌淀粉酶与杂质酶(如蛋白酶)的盐析沉淀举例 分段盐析曲线 W1浓度可除去大部分杂蛋白，此时目的酶很少沉淀析出，沉淀物分别后再加定量盐析剂至W2，此时，目的酶已根本沉淀析出，而杂蛋白很少混进目的酶中。有机溶剂沉淀法 1根本原理 降低水溶液的介电常数，减小溶剂的极性，从而减弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。 由于运用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏了蛋白质分子的水膜，因此发生沉淀作用。 2沉淀才干 普通有机溶剂的沉淀才干依次为丙酮异丙醇乙醇甲醇。 在食品级酶制剂消费中采用乙醇较多，特别是消费食品级酶制剂时

25、对卫生要求有保证。3有机溶剂的用量 常采用相当于酶液二倍体积的有机溶剂沉淀酶蛋白，在分段沉淀时，有机溶剂的最适浓度也应经过实验来确定。 假设采用逐渐提高有机溶剂浓度，它的用量可按公式计算： V = V0 (S2-S1)/(S-S2) 式中 V 和 V0 分别为参与的有机溶剂体积和原溶液的体积； S、 S1、S2 分别为待加的有机溶剂、原来溶液中含有的有机溶剂和溶液要到达的有机溶剂质量分数。4优缺陷 优点是分辨率高，溶剂易除去，适于食品级和药品级酶提纯。 缺陷是有机溶剂会破坏蛋白质的氢键，易引起变性失活，所以特别要留意搅拌均匀，尽能够减少其变性失活。5本卷须知： 1酶沉淀分别后，应立刻用水或缓冲

26、液溶解，以降低有机溶剂的浓度，防止变性。 2该法沉淀析出的酶普通比盐析法析出的容易过滤或离心分别，但有机溶剂沉淀法易使酶变性，所以操作必需在低温条件下进展。 3添加0.05mol/l的中性盐可以减少有机溶剂引起的酶变性，并可以提高酶的分别效果。 4有机溶剂沉淀法普通与等电点沉淀法结合运用，即操作时溶液的pH应控制在欲分别酶的等电点附近。 选择性变性沉淀法 这一方法是利用生物大分子与非目的生物大分子在物理化学性质等方面的差别，选择一定的条件使杂蛋白等非目的物变性沉淀而得到分别提纯。 1热变性 利用生物大分子对热的稳定性不同，加热升高温度使非目的生物大分子变性沉淀而保管目的物在溶液中。 2外表活性

27、剂和有机溶剂变性 那些对外表活性剂和有机溶剂敏感性强的杂蛋白变性沉淀。 3选择性酸碱变性 利用对pH值的稳定性不同而使杂蛋白变性沉淀。等电点沉淀法 根本原理： 蛋白质、酶是两性电解质，在等电点时溶解度最低，而且不同的酶和蛋白质具有不同的等电点。因此可以采用一定的措施使提取液的酸碱度到达某种酶或蛋白质的等电点，使其沉淀与其他物质分开，最终到达分别纯化酶的效果。 此法主要用于在分别纯化流程中去除杂蛋白，而不用于沉淀目的物。 有机聚合物沉淀法液液双水相抽提法 根本原理是根据一种或一种以上亲水性聚合物水溶液的不相溶性，细胞碎片、多糖、酯类、核酸及酶的性质不同，在两相分配系数不同，因此到达分别目的。 分

28、配系数K =CT/CB 式中 K 分配系数 CT 上相酶浓度(活力) CB 下相酶浓度(活力) K是由聚合物浓度、pH、离子强度、温度及被分别物质的量决议的。 双水相的构成： 两种不同水溶性聚合物浓度到达一定值时，体系会自然地分成互不相容的两相，构成双水相体系。 每一水相中均有很高的含水量，为酶等生物物质提供了一个良好的环境； 其中运用最多的是聚乙二醇(polyethylene glycol简写PEG) HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH (n 4)， 它的亲水性强，溶干水和许多有机溶剂，对热稳定，有广泛围的分子量，在生物大分子制备中，用的较多的是分子量为600020000的 PEG。几

29、种典型的双水相系统聚丙二醇 聚乙二醇、聚乙烯醇、葡聚糖 聚乙二醇（ PEG） 葡聚糖（Dex） 硫酸葡聚糖钠盐 聚丙烯乙二醇羧基甲基葡聚糖钠盐 甲基纤维素聚乙二醇（ PEG） 磷酸钾、硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁 几种典型的双水相萃取酶蛋白实例酶菌种相系统延胡索酸酶 Brevibacterium sp. PEG/ 盐 天冬氨酸酶 E. coli PEG/ 盐 -半乳糖苷酶 E. coli PEG/ 盐 亮氨酸脱氢酶 Bacillus sp. PEG/Dex 乙醇脱氢酶 Bakers yeast PEG/ 盐 青霉素酰化酶 E. coli PEG/ 盐 萃取实例 保依地尼假丝酵母菌(Candida b

30、oidinii)发酵产生的甲酸脱氢酶经四次延续抽提获得总收率为70，纯度70的产品。分别提纯甲酸脱氢酶：1一发酵罐发酵酶液 2一喷嘴式分别器搜集菌体 3一玻璃珠破碎细胞 4一热变性 5一第一次液液双水相抽提去除细胞碎片等物质 6一喷嘴式分别器搜集两相 7一第二次液液双水相抽提去除核酸、多糖及某些蛋白质 8一第三次液液双水相抽提为进一步提纯甲酸脱氢酶9一第四次液液双水相抽提为甲酸脱氢酶转入上相10一酶产品，在4可稳定几个月 本卷须知：A. 酶的分子量越大其被沉淀下来所需求的PEG浓度越低。B. 酶浓度高，易沉淀，但分别效果差，因此提取液中酶的浓度以小于10mg/ml为好。C. PEG的聚合度越高

31、，沉淀酶时所需求的浓度越低，但分别效果差，普通常用的是PEG2000-6000。D. PEG对酶有一定的维护作用，因此该方法可以在常温操作。E. 溶液的pH越接近酶的pI越易沉淀。F. 溶液的离子强度要适宜，普通离子强度小于2对PEG沉淀效果的影响不大。G. 沉淀后有机聚合物容易去除。二、根据酶分子大小、外形不同的纯化方法 1. 离心分别技术 2. 透析与超越滤技术 3. 过滤 4. 凝胶层析技术 离心分别技术1根本原理 借助离心机旋转时所产生的离心力，而使分子大小、外形不同的物质别分开来。2分类普通离心机 最大转速8000r/min，相对离心力RCF1104g高速离心机 最大转速2.5104

32、 r/min，相对离心力RCF2.5104 r/min，相对离心力RCF1-5105g 透析与超越滤技术 透析与超越滤技术是利器具有特定大小、均匀孔径的透析膜或超滤膜的筛分机理，在不加压或加压的条件下把酶提取液经过一层只允许水和小分子物质选择性透过的透析膜或超滤膜，酶等大分子物质那么被截留，从而到达把小分子物质从酶提取液中除去透析与超越滤或同时到达浓缩酶液的目的超越滤。 超越滤技术需求具有加压系统的超滤仪，而透析技术那么不需求专注的仪器。 超滤柱提纯大分子物质表示图压力：6.91046.9105Pa膜资料主要有：玻璃纸、再生纤维素、聚酰胺、聚砜等。各种膜分别技术的特点过滤 在酶的分别中，常需求

33、用过滤法从悬浮液中除去固体资料。 小规模过滤是廓清溶液的好方法。 运用助滤剂如C盐可改善过滤速度，C盐是硅藻土资料，主要由二氧化硅组成。 密理博Millipore公司开发出可进展大规模过滤的一种膜过滤片，这种过滤是强迫悬浮液颗粒总是处在膜上面，而液体在压力下可经过膜，所以悬浮液中的颗粒浓度越来越浓。凝胶层析技术 原理： 凝胶浸透色谱法 (Gel Permeation Chromatography，简称GPC法)，又称为分子筛层析法。其原理主要是利器具有网状构造的凝胶分子筛的作用，根据被分别物分子大小不同而分别。待分别系统中小分子物质直径比凝胶孔径小，可渗入凝胶微孔中，产生阻滞作用大、流程长、挪

34、动速度慢，最后流出；而大分子由于阻滞作用小，流程短，挪动速度快，先流出。 凝胶过滤原理表示图 Kd = (Ve V0)/ Vi 式中 Ve洗脱液体积 V0凝胶间空隙体积 Vi颗粒内部微孔体积 Kd分配系数，也就是溶质分子大小的一个函数。 当Kd = 1，即Ve = V0 + Vi，阐明该组分可进入微孔而最后流出。当Kd = 01之间，Kd 值小的先流出，大的后流出。Ve 、 V0 、 Vi可以经过实验测定。该法常用凝胶交联葡聚糖凝胶Sephadex 交联琼脂糖凝胶(Sepharose) 聚丙烯酰胺凝胶 交联葡聚糖凝胶(Sephadex) 凝胶是以葡聚糖凝胶为原料，交联剂为环氧氯丙烷，在碱性条件

35、下制成三维空间网状构造Sephadex。 目前市售Sephadex G10至G200共有8种。 G表示凝胶保水值，单位为mlg干胶，G后面的数字代表凝胶吸水量的10倍。 例：G-25表示每克干胶膨胀时吸水2.5ml，G-200表示每克干胶吸水20ml。 Sephadex是一种化学性质比较稳定的基质，不溶于水、盐、弱酸、碱。对热稳定，在中性条件下，湿态凝胶于110高温灭菌40min，性能与构造不变，而干态凝胶可耐受120的高温。交联琼脂糖凝胶(Sepharose) 琼脂糖是从天然琼脂中分别制备的链状多糖，琼脂糖凝胶内部具有较大的网孔，任务范围较大，主要用于分别相对分子质量超越40万的样品。 琼脂

36、糖的商品名因消费厂家不同而异，瑞典的商品名为Sepharose；美国的为Bio-Gel A；英国的为Segavac；丹麦的为Gelarose 。 琼脂糖凝胶具有良好的惰性，不带电荷，在层析中，对生物大分子几乎无非专注性吸附，对盐酸胍和尿素等变性剂有很强的抵抗力，但是对温度不稳定。Sepharose的运用温度为0-40，pH 稳定范围4-9。 Sepharose有三种型号：Sepharose 2B、4B和6B，数字表示凝胶中干胶的百分含量。从2B到6B，琼脂糖浓度逐渐添加，筛孔逐渐减小，机械强度依次增大。聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶是丙烯酰胺与交联剂N，N甲叉双丙烯酰胺聚合而成的网状高分子物质

37、。 以商品名Bio-Gel P-为例，P-后的数字乘以 1000，表示该种凝胶可运用于分别蛋白质的最高分子质量，P后面的数字越大，越适宜于大分子的分别。 该凝胶不溶于水和普通的有机溶剂，对浓盐、盐酸胍及尿素有抵抗力，pH值稳定范围为2-11。 聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，有弹性、透明、有较好的热稳定性和化学稳定性，是一种非离子型凝胶，故在酶和蛋白质纯化中得到广泛运用。同时，上述凝胶层析法还用于去除热原物质和制造无离子水，运用于脱盐、高分子溶液的浓缩等。 凝胶过滤层析法主要采用柱层析的方式。 柱层析操作过程包括：层析介质的平衡、膨润；装柱；加样；护展以及流出液成分的检测和分部搜集。 凝胶层析的

38、效果通常以洗脱曲线表示，以流出液中的蛋白质浓度(如A280)或酶活性相对洗脱(液)体积(Ve)的图形表示。 分辨率可用RS权衡，RS =两峰之间间隔峰宽，当RS = 1.2时，通常以为已到达分别效果。 凝胶过滤层析洗脱曲线峰带：1-Po；2-Ald；3-BSA；4-OVA；5-CTogen；6-RNasA 三、根据酶分子电荷性质的纯化方法一离子交换层析二电泳离子交换层析 离子交换层析是采用离子交换剂作为固定相，洗脱溶液为流动相的一种层析方法。在溶液中，溶质离子由于静电引力的作用，可结合到离子交换剂的功能基团上，同时置换出功能基团上的反离子，使之进入流动相。 交换过程如下式所用： RA+B+RB

39、+A+ 离子交换剂指含有解离性离子交换基团的高分子化合物，有两部分组成：一部分是大分子聚合物基质主体构造，一部分是具有荷电活性的功能基团。 根据离子交换剂所含功能团的酸碱性，可分为阳离子交换剂和阴离子交换剂两大类。 根据交换剂的基质性质，可分为离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换凝胶三种。 阳离子交换剂的电荷基团带负电，反离子带正电。可以与溶液中的正电荷化合物或阳离子进展交换反响。根据电荷集团的强弱，又可将阳离子交换剂分为强酸型和弱酸型两种。其作用原理可表示如下： 阴离子交换剂的电荷基团带正电，反离子带负电。可以与溶液中的负电荷化合物或阴离子进展交换反响。根据电荷集团的强弱，又可将阴离子交换

40、剂分为强碱型和弱碱型两种。其作用原理可表示如下：EXCH-X+ + P+EXCH-P+ + X+EXCH+Y- + P-EXCH+P- + Y- 离子交换层析之所以能胜利地把各种无机离子、有机离子或生物大分子物质分开，其主要根据是离子交换剂对各种离子或离子化合物有不同的结合力。 蛋白质、多肽等两性物质 当pHpI时，它们所带负电荷能与阴离子交换剂结合。 根据基质性质 1离子交换树脂：树脂是人工合成的疏水性物质，如聚苯乙烯、聚苯酚磺酸、聚丙烯酸等。 离子交换树脂的颗粒大小以目表示，目数越大表示树脂越细。 2离子交换纤维素：由纤维素作主体构造，纤维素上的OH基团被功能基团取代而构成的，属于亲水型离

41、子交换剂。 离子交换纤维素普通为白色，适用于生物大分子的分别纯化。 3离子交换凝胶 离子交换凝胶与离子交换纤维素一样，属于亲水型离子交换剂。它是以具有三维空间网状构造的葡聚糖或交联琼脂糖为基质，接入离子交换功能基团而制成的。 离子交换凝胶兼有分子筛和离子交换两种功能，有较高的电荷密度，其总交换量比离子交换纤维素大。但缺乏之处：当洗脱液的pH值和离子强度改动时，大部分离子交换凝胶的基质体积会发生较大的变化，呵斥柱体积压紧、流速降低。三、根据酶分子电荷性质的纯化方法一离子交换层析二电泳电泳 1、 定义带电颗粒在电场中向电荷方向相反的电极挪动 的景象称为电泳electrophoresis， EP。

42、2、分类 根据分别的原理可分为自在界面电泳、区带电泳、等速电泳、免疫电泳、毛细管电泳、印迹转移电泳； 根据支持物的类型可分为醋酸纤维素薄膜电泳、琼脂糖凝胶电泳、淀粉凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等； 根据电场的强度可分为高压电泳和常压电泳； 根据电泳的方式还可分为单向电泳和双向电泳。 在酶分别纯化中最广泛运用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳。 与其他凝胶相比，聚丙烯酰胺凝胶有以下优点：1在一定浓度下，凝胶透明、有弹性、机械性能好2化学性能稳定、与被分别物不发生化学反响3对pH和温度变化较稳定4几乎无电渗作用，样品分别反复性好5样品不易分散且用量少，其灵敏度可达10-6g6凝胶孔径可经过选择单体及交联剂的浓度调理7分辨率高。 四、根据酶分子专注性结合的纯化方法 一亲和层