细胞培养中的研究方法

1、细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法 侯桂琴侯桂琴 郑州大学药学院郑州大学药学院内容提要内容提要一、细胞生长状况观察一、细胞生长状况观察三、细胞凋亡检测三、细胞凋亡检测四、流式细胞术四、流式细胞术五、常用单细胞分离技术五、常用单细胞分离技术一、细胞生长状况观察一、细胞生长状况观察 1.1.常规观察常规观察 2.2.细胞计数细胞计数 3.3.细胞生长曲线细胞生长曲线 4.4.细胞分裂指数细胞分裂指数 5.5.细胞贴壁率细胞贴壁率 6.6.细胞周期细胞周期 1. 1.常规观察常规观察 倒置显微镜下观察，生长状态好的细倒置显微镜下观察，生长状态好的细胞透明度大，细胞内颗粒少，没有空泡。胞透明度大

2、，细胞内颗粒少，没有空泡。包膜清晰。培养液清澈透明，无悬浮细胞包膜清晰。培养液清澈透明，无悬浮细胞和碎片。和碎片。 从培养基颜色判断：正常桃红色，当从培养基颜色判断：正常桃红色，当变浅变黄，需换液或传代。变浅变黄，需换液或传代。 培养液浑浊，液体内漂浮菌丝或细菌，培养液浑浊，液体内漂浮菌丝或细菌，表示微生物污染。表示微生物污染。 细胞生长变慢，支原体污染。细胞生长变慢，支原体污染。2.2.细胞计数细胞计数细胞数细胞数/ml/ml（4 4大格细胞总数大格细胞总数/4/4）104 104 稀释倍数稀释倍数原理：台盼蓝排斥法。再结合原理：台盼蓝排斥法。再结合 ccdccd成像，成像，快速准确完成细胞

3、计数和存活率计数。快速准确完成细胞计数和存活率计数。注意事项：注意事项：1.1.细胞分散度较好，成单细胞悬液。细胞分散度较好，成单细胞悬液。2.2.取样计数前混匀细胞取样计数前混匀细胞3.3.计数时，计数时，2 2个以上细胞组成的细胞团按单个以上细胞组成的细胞团按单个细胞计算，细胞团占个细胞计算，细胞团占10%10%以上，说明消化以上，说明消化不充分；细胞数少于不充分；细胞数少于2 2个个/mm3/mm3或多于或多于5050个个/mm3/mm3，需重新制备细胞悬液。，需重新制备细胞悬液。3.3.细胞生长曲线细胞生长曲线 实验用细胞必须生长特征稳定，可采用细实验用细胞必须生长特征稳定，可采用细胞

4、计数法测定并绘制细胞生长曲线来观察细胞胞计数法测定并绘制细胞生长曲线来观察细胞状态。状态。方法：方法：取生长状态较好细胞接种取生长状态较好细胞接种24孔板，每孔板，每天或隔天计数（天或隔天计数（3个复孔），计数个复孔），计数1-2周，以细周，以细胞数对时间作图绘制生长曲线。胞数对时间作图绘制生长曲线。用用mtt法测定法测定96孔板中细胞生长孔板中细胞生长细胞倍增时间：细胞倍增时间：细胞数量增加一倍所需时间。细胞数量增加一倍所需时间。作图法：作图法：直接从图上找出直接从图上找出公式法公式法: : lg2 lg2dt=tdt=t lgnt-lgno lgnt-lgnont:nt:培养培养t t时间

5、后时间后细胞数细胞数no:no:首次计数，一首次计数，一般接种般接种24h24h进行进行4.4.细胞分裂指数细胞分裂指数 指分裂细胞占全部细胞中的比例，可指分裂细胞占全部细胞中的比例，可反映细胞增殖旺盛程度，一般计算观察反映细胞增殖旺盛程度，一般计算观察10001000个细胞。个细胞。5.5.细胞贴壁率细胞贴壁率6.6.细胞周期：细胞周期：同位素标记、流式细胞仪同位素标记、流式细胞仪二、细胞活力测定二、细胞活力测定1. 1. 细胞克隆形成率实验细胞克隆形成率实验（1）平板克隆形成试验）平板克隆形成试验适用于适用于贴壁生长的细胞（肿瘤、正常）贴壁生长的细胞（肿瘤、正常）方法步骤：方法步骤：1.1

6、.制备单细胞悬液制备单细胞悬液2.2.接种细胞：倍比稀释后接种于培养皿，每皿接接种细胞：倍比稀释后接种于培养皿，每皿接5050、100100、200200等梯度，轻摇（十字方向）使细胞分布均匀。等梯度，轻摇（十字方向）使细胞分布均匀。3.3.培养：培养：2-32-3周周4.4.染色：甲醇固定、吉姆萨染液染色染色：甲醇固定、吉姆萨染液染色5.5.计数：肉眼或显微镜计数：肉眼或显微镜（2）软琼脂克隆形成试验）软琼脂克隆形成试验适用于适用于悬浮细胞悬浮细胞方法步骤方法步骤1.制备单细胞悬液，制备单细胞悬液，103/ml2.制备底层琼脂：制备底层琼脂：50 5% 5%琼脂以琼脂以1 1：9 9和和37

7、37新鲜培新鲜培养基混合均匀铺入养基混合均匀铺入2424孔板，每孔孔板，每孔1ml1ml，室温凝固，室温凝固3. 50 5%3. 50 5%琼脂以琼脂以0.60.6：9.49.4和细胞悬液混合，加入上和细胞悬液混合，加入上述述2424孔板，每孔孔板，每孔1ml1ml。调节细胞数，一般每孔。调节细胞数，一般每孔2525、5050、100100个个4.4.培养培养2-32-3周周5.5.计数，计算克隆形成率计数，计算克隆形成率注意事项：注意事项：1.1.细胞充分分散细胞充分分散2.2.平板试验培养早期勿晃动平皿、软琼脂平板试验培养早期勿晃动平皿、软琼脂试验培养液与琼脂液混匀。试验培养液与琼脂液混匀

8、。3.3.防治污染防治污染缺点：缺点：难获得真正单细胞悬液难获得真正单细胞悬液 有些肿瘤细胞集落形成率低有些肿瘤细胞集落形成率低 确定集落有一定难度确定集落有一定难度 耗时长，重复性差耗时长，重复性差2.2.台盼蓝排斥试验台盼蓝排斥试验原理：台盼蓝能使死细胞着色（淡蓝色），而活细胞拒染。原理：台盼蓝能使死细胞着色（淡蓝色），而活细胞拒染。 活细胞总数活细胞总数100100活细胞率（活细胞率（ ） 活细胞总数死细胞总数活细胞总数死细胞总数注意：简单，最常用。染色时间不宜过长注意：简单，最常用。染色时间不宜过长3. 3. 四唑盐（四唑盐（mttmtt）比色法）比色法三、细胞凋亡检测三、细胞凋亡检测

9、1.1.形态学观察形态学观察2.2.电泳法电泳法3.3.原位切口末端标记法（原位切口末端标记法（tuneltunel）4.4.流式细胞术测定法流式细胞术测定法1.1.形态学观察形态学观察 细胞凋亡时，染色质固缩，细胞凋亡时，染色质固缩， hoechsthoechst染色时，细染色时，细胞核呈致密浓染。胞核呈致密浓染。25min25min。碧云天生物技术公司：碧云天生物技术公司：2.2.电泳法电泳法（dna ladder）原理：原理：凋亡细胞凋亡细胞dnadna被内源性核酸内切酶断被内源性核酸内切酶断裂成裂成180-200bp180-200bp的整数倍，电泳时形成梯度的整数倍，电泳时形成梯度条带

10、。条带。坏死细胞的坏死细胞的dnadna电泳呈模糊弥散条带。电泳呈模糊弥散条带。方法：方法：收集细胞，蛋白酶收集细胞，蛋白酶k k消化、酚消化、酚- -氯仿抽氯仿抽提细胞提细胞dnadna（试剂盒有卖），电泳。（试剂盒有卖），电泳。注意：注意：1.1.提提dnadna时细胞数勿太多，否则酶解不时细胞数勿太多，否则酶解不全，全，dnadna液粘稠液粘稠2.2.尽量用去尖头的枪头吸取尽量用去尖头的枪头吸取dnadna液，防液，防止人为剪切止人为剪切3.3.低电压电泳，利于低电压电泳，利于dnadna分离分离200bp400bp600bp800bp3.3.原位切口末端标记法原位切口末端标记法（原位细

11、胞凋亡检测，（原位细胞凋亡检测，tuneltunel）原理：原理：细胞凋亡时，内源性核酸内切酶使核小体内细胞凋亡时，内源性核酸内切酶使核小体内dnadna断裂出现缺口，产生一系列断裂出现缺口，产生一系列3-oh 3-oh 末端。生物素末端。生物素（biotinbiotin）标记的）标记的dutp dutp 在脱氧核糖核苷酸末端转移酶在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（tdttdt）的作用下与）的作用下与3-oh 3-oh 末端连接，并与连接了的末端连接，并与连接了的辣根过氧化酶的链霉亲和素（辣根过氧化酶的链霉亲和素（streptavidin-hrpstreptavidin-hrp）特）特异结合，加入异

12、结合，加入dabdab显色底物可在原位出现棕沉淀，镜下显色底物可在原位出现棕沉淀，镜下即可观察和计数着色细胞；即可观察和计数着色细胞； 正常或正在增殖的细胞几乎没有正常或正在增殖的细胞几乎没有dna dna 的断裂，因的断裂，因而没有而没有3-oh 3-oh 形成，很少能够被染色。形成，很少能够被染色。 组织样本组织样本和和细胞样本细胞样本（细胞涂片）均可检测。（细胞涂片）均可检测。优点：优点：对完整凋亡细胞进行原位染色，能准确对完整凋亡细胞进行原位染色，能准确反应凋亡细胞典型的生化和形态特征，极少量反应凋亡细胞典型的生化和形态特征，极少量的凋亡细胞也可被检测出来，灵敏度高于染色的凋亡细胞也可

13、被检测出来，灵敏度高于染色法和法和dna ladderdna ladder，应用广。，应用广。注意：注意：1.1.设好阳性及阴性对照，控制好药物处理时间设好阳性及阴性对照，控制好药物处理时间2.tdt2.tdt酶与生物素酶与生物素-dutp-dutp混合液现用现配混合液现用现配3.dab3.dab显色时间勿过长显色时间勿过长4.4.细胞爬片操作要轻柔细胞爬片操作要轻柔4.4.流式细胞术测定法流式细胞术测定法( (详见下节详见下节) )四、流式细胞术四、流式细胞术2020世纪世纪7070年代出现。年代出现。特点：特点：在单细胞水平上对大量细胞作准确在单细胞水平上对大量细胞作准确 快速分析和分选。

14、快速分析和分选。应用：应用：1.1.判断细胞体积、判断细胞体积、dnadna含量、蛋白含量、含量、蛋白含量、 酶活性、细胞膜受体、表面抗原等。酶活性、细胞膜受体、表面抗原等。2.2.无菌状态下，对活细胞分类收集，纯度无菌状态下，对活细胞分类收集，纯度 达达99%99%。流动室、流动室、液流系统液流系统激光光源激光光源光学系统光学系统光电管、光电管、检测系统检测系统计算机、计算机、分析系统分析系统工作原理：工作原理：1.1.检测单细胞不同指标检测单细胞不同指标 经荧光染色的单细胞悬液在气体压力下进经荧光染色的单细胞悬液在气体压力下进入流动室，在鞘液约束下细胞排成单列从喷嘴入流动室，在鞘液约束下细

15、胞排成单列从喷嘴喷出，形成细胞流。其与激光束垂直相交，细喷出，形成细胞流。其与激光束垂直相交，细胞被激发出荧光，经光学系统收集后，传给计胞被激发出荧光，经光学系统收集后，传给计算机系统储存、分析并显示。算机系统储存、分析并显示。 用不同单克隆抗体或荧光染料，可对一个用不同单克隆抗体或荧光染料，可对一个细胞同时进行多个参数检测。细胞同时进行多个参数检测。 当细胞液滴逐个通过激光束时，干涉检当细胞液滴逐个通过激光束时，干涉检测器被激活，而带荧光标记的细胞同时也使测器被激活，而带荧光标记的细胞同时也使荧光检测器激活，液滴充电信号使液滴带上荧光检测器激活，液滴充电信号使液滴带上负电荷，从而向正极移动，

16、进入荧光标记细负电荷，从而向正极移动，进入荧光标记细胞收集器，纯度达胞收集器，纯度达99%99%以上。以上。 无菌状态下进行时，得到细胞仍可继续无菌状态下进行时，得到细胞仍可继续体外培养，进行后续研究。体外培养，进行后续研究。2.2.细胞分选细胞分选流式细胞仪使用流式细胞仪使用1.1.调试和校准：激光强度、液流速度、光路等、调试和校准：激光强度、液流速度、光路等、由专业技术人员进行。由专业技术人员进行。2.2.仪器操作：仪器操作：打开细胞仪打开细胞仪 打开联机电脑打开联机电脑 在气压阀减压状态下确认鞘液桶充满并保证在气压阀减压状态下确认鞘液桶充满并保证管路通畅管路通畅 气压阀加压排出管路气泡气

17、压阀加压排出管路气泡 样品样品管加去离子水冲洗喷嘴系统管加去离子水冲洗喷嘴系统 预热预热5-10min5-10min开开始试验始试验 完毕后去离子水冲洗完毕后去离子水冲洗 分析结果分析结果常规样品制备方法常规样品制备方法1.1.直接荧光标记法：直接荧光标记法： 直接用荧光素（直接用荧光素（fitcfitc、pepe等）标记的抗体处理细胞，等）标记的抗体处理细胞，进行检测（可同时加入几种不同荧光标记的抗体）。进行检测（可同时加入几种不同荧光标记的抗体）。 此法操作简单，结果准确，易于分析。此法操作简单，结果准确，易于分析。2.2.间接荧光标记法：间接荧光标记法： 细胞先与一抗结合，再加荧光标记的

18、二抗检测。细胞先与一抗结合，再加荧光标记的二抗检测。 此法费用低，但特异性差（二抗多为多克隆抗体），此法费用低，但特异性差（二抗多为多克隆抗体），应设好阴阳对照。不适合细胞数少的标本测定。应设好阴阳对照。不适合细胞数少的标本测定。应用实例应用实例1.1.检测细胞膜受体检测细胞膜受体原理：原理：细胞表面保留有完整的抗原，用荧光标记的特细胞表面保留有完整的抗原，用荧光标记的特异性抗体与细胞表面抗原结合，依荧光强度或阳性百异性抗体与细胞表面抗原结合，依荧光强度或阳性百分率可知相应抗原密度。分率可知相应抗原密度。步骤：步骤：对数期细胞单细胞悬液，对数期细胞单细胞悬液，pbspbs洗涤，调浓度洗涤，调浓

19、度为为1 1107107个个/ml/ml；取取100ul100ul，加血清封闭；，加血清封闭；加抗原加抗原避光孵育避光孵育20min20min， pbspbs洗涤洗涤2 2次；次；弃上清，用弃上清，用固定液固定液固定细胞；固定细胞；检测检测检测结果检测结果注意事项注意事项1.1.上机前细胞浓度上机前细胞浓度1 110106 6个个/ml/ml，过高或低，过高或低 均影响结果均影响结果2.2.设立对照设立对照3.3.抗体孵育后充分洗涤，轻柔混匀，低速抗体孵育后充分洗涤，轻柔混匀，低速 离心，以减少重叠细胞和细胞碎片离心，以减少重叠细胞和细胞碎片4.4.孵育时避光孵育时避光2.2.同时检测细胞内外

20、抗原同时检测细胞内外抗原原理：原理：先标记膜抗原，固定后用破膜剂或先标记膜抗原，固定后用破膜剂或打孔剂将胞膜破坏，再标记胞内抗原，测打孔剂将胞膜破坏，再标记胞内抗原，测定阳性百分率。定阳性百分率。注意：注意：抗原用不同荧光标记抗原用不同荧光标记设立阴性对照设立阴性对照避光操作避光操作原理：原理：碘化丙啶（碘化丙啶（pipi）可与胞内）可与胞内dnadna及及rnarna结合，用结合，用rnarna酶消化后，酶消化后，pipi的荧光强度反应胞内的荧光强度反应胞内dnadna含量。因含量。因细胞周期各时相的细胞周期各时相的dnadna含量不同，故区分出来。含量不同，故区分出来。g1/g0g1/g0

21、：二倍体细胞：二倍体细胞dnadna含量（含量（2n2n）g2/mg2/m：4n s4n s：二者之间：二者之间凋亡细胞总凋亡细胞总dnadna含量降低，在含量降低，在g1/g0g1/g0细胞群前出现一细胞群前出现一dnadna低染细胞群，即低染细胞群，即g1g1峰前出现二倍体峰，即凋亡峰前出现二倍体峰，即凋亡细胞群。细胞群。3.3.细胞周期及凋亡检测细胞周期及凋亡检测方法步骤：方法步骤：1.收集不同方法或药物处理的细胞，收集不同方法或药物处理的细胞，70%冷冷乙醇固定乙醇固定20min ，4放置（最长放置（最长4 4周）周）2.pbs2.pbs清洗两次出去固定液，清洗两次出去固定液，pbsp

22、bs调细胞浓度调细胞浓度为为2 210107 7个个/ml/ml3.3.加入加入rnase a rnase a 消化半小时，加入消化半小时，加入pipi，4 4 避光避光20min20min4.4.检测检测检测结果：检测结果：注意事项：注意事项：1.1.细胞收集后及时固定，防止自溶或细胞收集后及时固定，防止自溶或dnadna降解降解2.2.要用对细胞穿透性强的固定剂，一般要用对细胞穿透性强的固定剂，一般70%70%乙醇乙醇3.3.上机检测前细胞浓度要足够，一般上机检测前细胞浓度要足够，一般1 1106106个个/ml/ml，杂质、碎片和重叠细胞，杂质、碎片和重叠细胞2%2%（可用合适目数（可用

23、合适目数筛子过滤）筛子过滤）4.4.反应的凋亡结果应考虑的因素：反应的凋亡结果应考虑的因素：dnadna含量降低含量降低或或dnadna结构改变使结构改变使dnadna可染性降低。可染性降低。原理：原理：正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（psps）只）只分布在胞膜脂质双层内侧，细胞凋亡早期，分布在胞膜脂质双层内侧，细胞凋亡早期，psps翻转到膜外。膜联蛋白翻转到膜外。膜联蛋白v v（annexin-vannexin-v）是）是一种磷脂结合蛋白，可与一种磷脂结合蛋白，可与psps特异性结合，检特异性结合，检测早期凋亡细胞。以荧光素测早期凋亡细胞。以荧光素fitcfitc标记的标

24、记的annexin-vannexin-v作探针，配合作探针，配合pipi，可用流式细胞仪，可用流式细胞仪将凋亡早期。凋亡晚期及死细胞区分开。将凋亡早期。凋亡晚期及死细胞区分开。 4.4.细胞凋亡和坏死检测细胞凋亡和坏死检测方法步骤：方法步骤：1.1.收集不同方式或药物处理的细胞，调整浓度收集不同方式或药物处理的细胞，调整浓度为为1-51-51071072.2.预冷结合缓冲液（可置冰上）洗涤两次预冷结合缓冲液（可置冰上）洗涤两次（1000r/min,5min1000r/min,5min）3.3.用用250ul250ul结合缓冲液重悬，使细胞浓度为结合缓冲液重悬，使细胞浓度为1 11071074.

25、4.取取100ul100ul置于流式样品管，加置于流式样品管，加5ul annexin-v5ul annexin-v和和pipi，避光孵育，避光孵育15min15min5.5.加入加入400ul pbs400ul pbs，选择合适波长测定，选择合适波长测定 正常细胞：正常细胞：v v（- -） pipi（- -） 早期凋亡：早期凋亡： v v（+ +） pipi（- -） 晚期凋亡或坏死：晚期凋亡或坏死： v v（+ +） pipi（+ +）依据：依据：正常细胞和早期凋亡细胞胞膜完整，故正常细胞和早期凋亡细胞胞膜完整，故pipi拒染；拒染；正常活细胞正常活细胞psps不外翻，故不外翻，故ann

26、exin-vannexin-v拒染，胞膜拒染，胞膜完整，完整，pipi拒染；拒染；晚期及坏死细胞膜受损，晚期及坏死细胞膜受损，psps外翻，二者均染色外翻，二者均染色结果判定：结果判定：检测结果：检测结果： i i：晚期凋亡细胞：晚期凋亡细胞 iiii：早期凋亡细胞：早期凋亡细胞iiiiii：活细胞：活细胞iiiiii注意事项：注意事项：1.1.操作中动作轻柔，低速离心，勿用力吹打操作中动作轻柔，低速离心，勿用力吹打 细胞，尽量冰上操作细胞，尽量冰上操作2.2.与荧光染料反应完尽快检测，与荧光染料反应完尽快检测，1h1h后荧光衰减后荧光衰减3. annexin v-fitc3. annexin v-fitc和和pipi是光敏物质，操作是光敏物质，操作 时避光时避光4.4.试剂作用时间的影响试剂作用时间的影响5.pi5.pi能透皮吸收，勿直接接触能透