分离工程第七章

1、第七章 亲和纯化w 生物亲和作用生物亲和作用生物物质，特别是酶与抗体等蛋白质，具有识别特定物质并与该物质的分子相结合的能力；这种识别并结合的能力具特异性，即能够区分结构和性质非常相近的不同分子，选择性地与其中一种分子结合。生物分子间的这种特异性相互作用称为生物亲和作用（bioaffinity）或简称亲和作用。通过亲和作用发生的结合称特异性结合（specific binding）或亲和结合（affinity binding）。w 亲和纯化技术亲和纯化技术定义：利用生物分子间的这种特异性结合作用的原理进行生物物质分离纯化的技术。应用：通常与其他分离纯化技术相结合，如亲和层析技术、亲和膜分离技术等。

2、第一节 基本原理一、亲和作用的本质w 参与亲和作用的两个分子中，其中之一为蛋白质的情况占绝大多数，或者两者均为蛋白质。w 蛋白质参与亲和作用的机理蛋白质参与亲和作用的机理一般认为蛋白质的立体结构中存在结合位点，呈凹陷或凸起结构。同时，具有亲和作用的分子间还需分子或原子水平的各种相互作用，主要包括静电作用、氢键力、疏水性相互作用、配位键、弱共价键等。生物亲和作用是一种复杂的生物现象，这也是亲和作用特异性高的主要原因。二、亲和作用体系w 生物物质中常见的亲和作用体系有：生物物质中常见的亲和作用体系有：w 酶与其底物；含有糖基的酶或蛋白质分子通过糖基与植物凝集素结合；酶或蛋白质作为抗原与其抗体结合等

3、。w 外源凝集素是一种天然蛋白质，大多数可由植物中制取，外源凝集素具有类似抗体的活性，并于一些糖的残基或链段。有高度的亲和力，广泛用于糖蛋白，糖多肽，多糖化合物以及糖脂的检测，分析 和纯化。 w 在亲合层析分离中，它们与层析剂结合，可用来分离整个细胞、细胞表面受体蛋白、细胞膜片段及各种含糖配基的生物大分子物质。w 亲和作用体系的特异性亲和作用体系的特异性高度特异性体系：一对一关系，如抗原与其单克隆抗体的结合。群特异性体系：大多数亲和体系，如外源凝集素可与任何含有糖基的蛋白质结合。三、亲和纯化原理w 将具有亲和作用的两种分子中的一种分子与固体粒子或可溶性物质共价偶联，特异性吸附或结合另一种分子，

4、使另一种分子（目标物质）容易从混合物中得到选择性分离纯化。w 亲和配基：亲和配基：亲和作用分子对中被固定的分子。w 结合常数结合常数 el = el 其中：e、l和el分别表示目标物质、配基和二者形成的复合体。 keq一般为104108dm3/mol，太大洗脱回收困难，太小则难于有效吸附目标物质。 lelekeq第二节 亲和层析一、原理与操作w 原理原理利用偶联亲和配基的亲和吸附介质为固定相亲和吸附目标产物，使目标产物得到分离纯化的液相层析法。w 操作操作包括进料吸附、清洗、洗脱和再生等步骤。洗脱方法有 特异性洗脱利用含有与亲和配基或目标产物具有亲和作用的小分子化合物溶液为洗脱剂，通过竞争性结

5、合作用，脱附目标产物。相当于顶替展开特点：条件温和，有利于保护目标产物的活性和提高纯度。 非特异性洗脱通过调节洗脱液的ph值、离子强度、离子种类或温度等理化性质降低目标产物的亲和作用，使之脱附。是较多采用的洗脱方法。要求操作对目标产物活性无影响。二、亲和吸附介质w 一般情况下，需根据目标产物选择合适的亲和配基修饰固体粒子，制备所需的亲和吸附介质。该固体粒子通常称为配基的载体。w 亲和配基：亲和配基：可选择的有酶的抑制剂、抗体、a蛋白、凝集素、辅酶和磷酸腺苷、三嗪类色素、过滤金属离子、组氨酸和肝素等。w 对载体的要求对载体的要求具有亲水性多孔结构，无非特异性吸附，比表面积大；物理和化学稳定性高，

6、有较高的机械强度，使用寿命长；含有可活化的反应基团，用于亲和配基的固定化；粒径均一的球形粒子。w 常用制备亲和吸附介质的方法有：常用制备亲和吸附介质的方法有：cnbr活化法、环氧基活化法和硅胶的活化。w间隔臂间隔臂当配基的分子量较小时，将其直接固定在载体上，会由于载体的空间位阻，配基与生物大分子不能发生有效的亲和吸附作用。在配基与载体之间连接间隔臂，可增大配基与载体之间的距离，使其与生物大分子发生有效的亲和结合。含有68亚甲基，亲和力最大。oh+ch2ochch2cloch2chch2o+pnh2och2nhp表氯醇activation三、应用w 最初用于蛋白质特别是酶的分离和精制上，后来发展

7、到大规模应用在酶抑制剂、抗体和干扰素等的分离精制上。w 思考题：制备亲合吸附介质时，为什么需要在配基与载体之间引入间隔臂？第三节 亲和膜一、原理w 利用亲和配基修饰的微滤膜为亲和吸附介质亲和纯化目标蛋白质，是亲和层析的变形，故又称膜亲和层析。w 微滤膜比喻为固定床，则膜厚即为床层高度。亲合配基固定在膜孔表面。流体在透过膜过程中目标蛋白质与配基接触而被吸附。二、应用及特点w 应用：应用：如单克隆抗体的纯化、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（g6pdh）的纯化等。w 实验证明：cibacron blue f3ga（活性染料，与nad 结构类似）是许多酶的和蛋白质极有效的吸附剂：如与辅酶a有关的酶。磷酸激酶，

8、脱羧酶，dna和rna的核酸酶和聚合酶以及干扰素等。w 特点特点优点 传质阻力小，达到吸附平衡时间短，配基利用率高； 压降小，流速高，设备体积小，配基用量低。缺点 理论板数很低，吸附和清洗效率低； 膜的污染会使操作速度、吸附效率和亲和膜的寿命下降。 思考题：简述亲和膜层析的原理和特点第四节 亲和错流过滤一、原理和操作w 原理：原理：acff又称亲和过滤或亲和超滤，是生物亲和作用与膜分离相结合的蛋白质类生物大分子的分离纯化技术，是亲和层析的另一种变形。w 利用被膜截留的水溶性高分子化合物或不溶性微粒为载体的固定亲合配基。亲合吸附目标蛋白从而增大目标分子和杂蛋白尺寸差别。分子量差10倍才能完全分离

9、。w 操作：操作：一般包括进料吸附、清洗、洗脱和再生等步骤。 二、应用和特点w 应用：应用：如伴刀豆球蛋白（con a）的纯化，连续亲和循环提取（care）纯化-半乳糖苷酶等。w 特点特点优点 以压差为推动力，速度快，易于放大和实现连续化操作； 选择性高，纯化水平接近或达到亲和层析； 载体一般为水溶性聚合物或无孔微粒，无内扩散传质阻力，目标分子的亲和结合速度快； 不需使用高压设备，可弥补高效亲和层析设备昂贵、放大困难的缺点。缺点 相当于层析过程的一个理论板，分离效率较低。 思考题：简述亲合错流过滤技术分离蛋白质的操作过程？第五节 其他亲和纯化技术一、亲和双水相分配w 原理：原理：利用偶联亲和配

10、基的peg为成相聚合物进行目标产物的双水相萃取，可在亲和配基的亲和结合作用下促进目标产物在peg相的分配，提高目标产物的分配系数和选择性。w 操作：操作：包括亲和分配（进料）、杂蛋白反萃取（清洗）和目标产物反萃取（洗脱）等步骤。二、亲和反胶团萃取w 原理：原理：在反胶团相中除通常的表面活性剂（如aot）以外，添加另一种亲水头部为目标分子的亲和配基的助表面活性剂，通过亲和配基与目标分子的亲和结合作用，促进目标产物在反胶团相的分配，提高目标产物的分配系数和反胶团萃取分离的选择性。w 一般将含配基的助表面活性剂称为亲合助表面剂。三、亲和沉淀w 定义：定义：生物亲和作用与沉淀分离相结合的蛋白质类生物大分子的分离纯化技术。w 原理原理一次作用亲和沉淀 水溶性化合物分子上偶联两个或两个以上亲和配基，与含有两个以上亲和结合部位的多价蛋白质产生亲和交联，进而增大为较大的交联网络而沉淀。二次作用亲和沉淀 利用在物理场（如ph、离子强度、温度和添加金属离子等）改变时溶解度下降、发生可逆性沉淀的水溶性聚合物为载体固定亲和配基，制备亲和沉淀介质。亲和介质结合目标分子后，通过改变物理场使介质与目标分子共同沉淀。w 优点优点亲和结合作用在自由溶液中进行，无扩散传质阻力，亲和结合速度快；