(待分)rtpcr原理和实验步骤

1、原理与实验步骤一、知识背景：、基因表达： 单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因一个丝心蛋白（每个存活，可以合成个丝心蛋白）共合成个丝心蛋白。因此单拷贝基因的表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。k、技术（）：即聚合酶链式反应。在模板、引物和四种脱氧核甘酸存在的条件下依赖于聚合酶的酶促反应，其特异 性由两我工合成的引物序列决定。反应分三步：.变性：通过加热使双螺旋的氢键断裂，形成单链。.退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。.延伸：在聚合酶和及+存在下，退火引物沿 方向延伸。一以上三步为一个循环，如此反复。、逆转录酶和逆转录酶（）是存在于病毒体内的依赖的聚合酶，

2、至少具有以下三种活性：、依赖的聚合酶活性：以为模板合成第一条链。、水解活性：水解杂合体中的。、依赖的聚合酶活性：以第一条链为模板合成互补的双链二、的准备：.引物的设计及其原则：）引物的特异性决定反应特异性。因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要 的影响。在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型，不 同的剪切方式以及可能存在的对引物的特异性的影响。尽量选择覆盖相连两个内含子 的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。）引物设计原则的把握引物设计原则包括：、引物长度：一般为，引物太短会影响的特异性，引物太长的最适延伸温度会超过酶 的最适温度，

3、也影响反应的特异性。、碱基分布：四种碱基最好应随机分布，避免嗯吟或喀咤的聚集存在，特别是连续出 现个以上的单一碱基。含量（值）：-%,扩增的复性温度一般是较低值减去 度。、端要求：端必须与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构 的可能。末位碱基是时错配的引发效率最低，、居中间，因此引物的端最好选 用、而尽可能避免连续出现两个以上的。、引物自身二级结构：引物自身不应存在互补序列，否则会自身折叠成发夹状结构或 引物自身复性。、引物之间的二级结构：两引物之间不应有多于个连续碱基互补，端不应超过个。、同源序列：引物与非特异扩增序列的同源性应小于连续个的互补碱基存在。、端无严格限制：末

4、端碱基可以游离，但最好是或，使产物的末端结合稳定。还 可以进行特异修饰（标记、酶切位点等）等等。根据实验目的选择适当的引物。常用引物设计软件如，等对于这些条件都可以自 行设置。、耗材：实验所用的接触样品的耗材如冻存管、枪头、管之类事先都需经过水浸泡处理， 除去酶，防止操作过程中降解。然后经高压灭活（灭菌和灭活）。、试剂准备：变性液、水饱和酚、乙酸钠、氯仿、异丙醇、酒精、经处理并高压的水。三、的提取方法中从细胞分离的的质量至关重要，包括的纯度和完整性。分离的最关键因素是 尽量减少酶的污染。但酶活性非常稳定，分布广泛，除细胞内源性酶外，环境中也存 在大量酶。因此在提取时，应尽量创造一个无酶的环境，

5、包括去除外源性酶污染和抑 制内源性酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（）去除外源性酶，通过酶的阻抑蛋白和 强力的蛋白质变性剂如异硫鼠酸月瓜抑制内源性酶。RT-PCR 步骤：1、RNA的提职界W上清加1 El7旧用己番，吹打悬起沉淀，空温静置5min （可_2口 p保存） 4 t? 75O0g X并上清，灭菌清纸U加适量CNOUI左右口EFG处理过的水,-溶解RNA （. dJ -20七 保存，, 取23辎群5。倍，于核酸生臼测定，cDNA的合成，逆转录体系的组成iDEPC处理水8ul10mM dNTPs2.5ulRandom primers0.4ulRNasin0.5ul忌、RNA2.5 -3us

6、u70C 5minn速置冰水中冷却u再加=5*逆转录buffer5ul逆转录酶lul(200U) 加水至25ulu37 C 60mhi90 IC 5min3、PCR扩增：50111PCR体系的组成：lOxpCRbuffer5ulMg Cl： lOmMdNTPssense primer antisensi? primercDNA DEPC处理水 Taq 酶4. PCR反应条件94 r94 V退火温度72 ALam li PhTtj XU Tea） RNALum J: rwriMt*KNA1% 加tuHng A我抖n）n Gd Total RNA的变性琼脂糖凝胶检测试齐I：()缓冲液(*)吗咻代丙烷磺酸()()，。()上样染料：甘油， 澳酚蓝，二甲苯蓝。()甲醛。()去离子甲酰胺。电泳槽清洗：去污剂洗干净(一般浸泡过夜)一一水冲洗乙醇干燥一一灌满一一室温放置分钟一一水冲洗。操作：()将制胶用具用乙醇冲洗一遍，晾干备用。()配制琼脂糖凝胶。称取琼脂糖，置干净的 锥形瓶中，加入蒸储水，微波炉内加热使琼脂糖彻底 溶化均匀。待胶凉至C,依次向其中加入 甲醛、 缓冲液和 澳化乙锭，混合均匀。灌制琼脂糖凝胶。()样品准备：取处理过的小离心管，依次加入如下试