第四章诱变剂

1、 凡能诱发生物基因发生突变且突变率远远超过凡能诱发生物基因发生突变且突变率远远超过自发突变率的物理因子和生物化学物质统称为诱自发突变率的物理因子和生物化学物质统称为诱变剂。变剂。包括：包括：物理诱变剂；化学诱变剂；生物诱变剂物理诱变剂；化学诱变剂；生物诱变剂诱变剂诱变剂第一节第一节 物理诱变剂物理诱变剂第二节第二节 化学诱变剂化学诱变剂第三节第三节 生物诱变剂生物诱变剂主要内容主要内容 第一节第一节 物理诱变剂物理诱变剂指物理辐射中的各种射线，包括紫外线、物理诱变剂指物理辐射中的各种射线，包括紫外线、x x射线、射线、射线、快中子、射线、快中子、射线、射线、射线、微波、射线、微波、超声波、电磁

2、波、激光等。超声波、电磁波、激光等。诱变中常用的是紫外线（诱变中常用的是紫外线（uvuv）、）、x x射线、射线、 射线、射线、快中子。快中子。 物理辐射可分为物理辐射可分为电离辐射电离辐射（ionizing radiationionizing radiation）、）、非电离辐射非电离辐射（nonionizing radiationnonionizing radiation）。）。 单位：量子。单位：量子。一、物理诱变剂的生物学效应一、物理诱变剂的生物学效应物理诱变剂对微生物的诱变作用主要是由物理诱变剂对微生物的诱变作用主要是由高能辐射高能辐射引起引起生生物系统损伤物系统损伤，继而发生，继而

3、发生遗传变异遗传变异的一系列复杂的连锁反应的一系列复杂的连锁反应过程。过程。作用过程可分为物理、物理作用过程可分为物理、物理- -化学、化学、生物学等几个阶化学、化学、生物学等几个阶段。段。辐射引起生物学效应的影响因素辐射引起生物学效应的影响因素 微生物的遗传背景微生物的遗传背景 微生物的生理状态微生物的生理状态 可见光可见光 水分水分 温度温度 空气或氧气空气或氧气二、非电离辐射二、非电离辐射紫外线紫外线1.1.紫外线的诱变机制紫外线的诱变机制形成嘧啶二聚体形成嘧啶二聚体2.dna2.dna损伤修复损伤修复光修复光修复切补修复切补修复（一）紫外线的诱变机制和（一）紫外线的诱变机制和dnadn

4、a损伤修复损伤修复（二）紫外线诱变（二）紫外线诱变1 1、紫外线的有效光谱、紫外线的有效光谱 能诱发微生物突变的紫外线的有效波长范围是能诱发微生物突变的紫外线的有效波长范围是200200300nm300nm，最有效的波长为，最有效的波长为253.7nm253.7nm。2 2、紫外线的辐射剂量、紫外线的辐射剂量有绝对剂量和相对剂量之分。有绝对剂量和相对剂量之分。绝对剂量：单位绝对剂量：单位erg/mmerg/mm2 2（1erg=101erg=10-7-7j j）用用剂量仪剂量仪测定测定相对剂量：单位用相对剂量：单位用照射时间照射时间或或杀菌率杀菌率表示。表示。剂量决定于紫外灯功率、灯管与照射物

5、的距离及照射剂量决定于紫外灯功率、灯管与照射物的距离及照射时间。时间。15w15w紫外灯、紫外灯、30cm30cm灯距、杀菌率灯距、杀菌率909099.999.9时不同微生时不同微生物的照射时间：物的照射时间：一般芽孢：一般芽孢：10min10min一般微生物营养体：一般微生物营养体：3 35min5min无芽孢菌和革兰氏阴性菌：无芽孢菌和革兰氏阴性菌：0.50.52min2min因此，某种微生物的最适剂量并不一定适合另一种。因此，某种微生物的最适剂量并不一定适合另一种。3 3、紫外线诱变的步骤与方法、紫外线诱变的步骤与方法 出发菌株出发菌株 细菌：培养到对数期；霉菌、放线菌：孢子刚成熟。细菌

6、：培养到对数期；霉菌、放线菌：孢子刚成熟。 前培养前培养制备营养丰富培养基制备营养丰富培养基将菌体培养到最佳生理状态将菌体培养到最佳生理状态 制备菌悬液制备菌悬液离心离心生理盐水悬浮，玻璃珠分散生理盐水悬浮，玻璃珠分散过滤过滤要求：分散度：要求：分散度：9090-95-95 菌体浓度：细菌：菌体浓度：细菌：1 110108 8mlml-1-1; ;放线菌放线菌10107 710108 8mlml-1-1 霉菌：霉菌： 10106 610107 7mlml-1-1 方法：方法： 紫外线照射紫外线照射紫外灯预热紫外灯预热将菌悬液放入平皿将菌悬液放入平皿照射照射 后培养后培养 稀释涂布稀释涂布三、三

7、、 电离辐射电离辐射1、电离辐射的种类、特征与来源、电离辐射的种类、特征与来源2、电离辐射剂量、电离辐射剂量radrad（拉德）：快中子的剂量单位。（拉德）：快中子的剂量单位。1g1g被照射物质被照射物质吸收吸收100 erg100 erg辐射能量的射线剂量为辐射能量的射线剂量为1rad1rad。r r（伦琴）：（伦琴）：x /x /射线的剂量单位。射线的剂量单位。1cm1cm3 3干燥空干燥空气在气在0,1.01x100,1.01x105 5帕下产生帕下产生2.082.0810109 9离子对时所离子对时所需能量。需能量。吸收剂量（符号为吸收剂量（符号为d d）和吸收剂量率）和吸收剂量率适合

8、于适合于射线、射线、射线、中子等任何电离辐射。射线、中子等任何电离辐射。吸收剂量：指被照射物某一点上单位质量中所吸收的能吸收剂量：指被照射物某一点上单位质量中所吸收的能量值。量值。国际单位：戈国际单位：戈瑞（瑞（gygy）1kg1kg被照射物吸收电离辐射的能量为被照射物吸收电离辐射的能量为1j1j（焦耳）时称为（焦耳）时称为1gy1gy。即：。即：1gy=1j/kg1gy=1j/kg。原专用单位：原专用单位：radrad（拉德）（拉德） 1rad=101rad=10-2-2j/kg=10j/kg=10-2-2gy gy 即：即： 1gy=100rad1gy=100rad吸收剂量率：是指单位时间

9、内的吸收剂量。吸收剂量率：是指单位时间内的吸收剂量。单位：单位：gy/h gy/min gy/sgy/h gy/min gy/srad/h rad/min rad/s rad/h rad/min rad/s 3 3、电离辐射的照射方法、电离辐射的照射方法 直接对平皿上生长的菌直接对平皿上生长的菌落进行照射。落进行照射。 用打孔器（用打孔器（6-10mm6-10mm）将菌）将菌落连同基质一同取出放于无菌落连同基质一同取出放于无菌平皿内照射。平皿内照射。 制成菌悬液，取制成菌悬液，取1-2ml1-2ml置于试管内并浸入冰水中置于试管内并浸入冰水中进行短时间照射。进行短时间照射。快中子：致死率为快中

10、子：致死率为5085比较合适，采用剂比较合适，采用剂量约为量约为1530k rad。有利于正突变的产生。有利于正突变的产生。x射线、射线、射线：杀菌率射线：杀菌率9099.9为宜。照为宜。照射剂量为射剂量为1万万20万万r。四、近年来发展的新型诱变剂四、近年来发展的新型诱变剂1.1.微波：电磁波，分热效应和非热效应。辐射中采用分散微波：电磁波，分热效应和非热效应。辐射中采用分散低温干燥法消除微波热效应的影响。低温干燥法消除微波热效应的影响。2.2.红外射线：红外射线：光谱的波长范围大于可见光小于无线电波的电光谱的波长范围大于可见光小于无线电波的电磁辐射区域的光波。磁辐射区域的光波。3.3.激光

11、：是二十世纪六十年代发展起来的一种新光源。激光：是二十世纪六十年代发展起来的一种新光源。可通过产生闪、热、压力和电磁场效应的综合作用，直可通过产生闪、热、压力和电磁场效应的综合作用，直接或间接地影响生物活性。常见的是接或间接地影响生物活性。常见的是he-nehe-ne激光。激光。4.4.高能电子流：是较强的电离辐射。高能电子流：是较强的电离辐射。5.5.离子注入：是二十世纪八十年代兴起的一种新技术。利离子注入：是二十世纪八十年代兴起的一种新技术。利用离子注入生物体引起遗传物质的改变，导致性状的变异，用离子注入生物体引起遗传物质的改变，导致性状的变异，从而达到育种的目的。突变率高。从而达到育种的

12、目的。突变率高。6. 6. 航天育种：航天育种： 利用太空微重力、高能粒子、高真空、利用太空微重力、高能粒子、高真空、缺氧和交变磁场等缺氧和交变磁场等综合物理诱变因子综合物理诱变因子进进行诱变和选择育种研究。行诱变和选择育种研究。第二节第二节 化学诱变剂化学诱变剂：化学诱变剂：凡是能改变凡是能改变dnadna结构，并引起生物遗传变异的结构，并引起生物遗传变异的化学物质。化学物质。种类：种类：很多，在育种中常用的诱变剂包括四大类：碱基类很多，在育种中常用的诱变剂包括四大类：碱基类似物、烷化剂、移码诱变剂、其它。似物、烷化剂、移码诱变剂、其它。特点：特点：1.1.作用机制：都是与作用机制：都是与d

13、nadna起化学反应，诱变效应与其理化性起化学反应，诱变效应与其理化性质有关。质有关。2.2.作用具专一性。作用具专一性。3.3.诱变剂量取决于浓度和处理时间。诱变剂量取决于浓度和处理时间。4.4.绝大多数化学诱变剂都具有毒性，其中绝大多数化学诱变剂都具有毒性，其中9090以上是致癌物以上是致癌物质或极毒物质。质或极毒物质。一、碱基类似物一、碱基类似物定义：指一类和天然碱基分子结构类似的物质，既能诱定义：指一类和天然碱基分子结构类似的物质，既能诱发正向突变，也能诱发回复突变的诱变剂。发正向突变，也能诱发回复突变的诱变剂。掺入诱变剂掺入诱变剂类别：类别：胸腺嘧啶类似物：胸腺嘧啶类似物： 5-fu

14、; 5-iu 5-fu; 5-iu腺嘌呤类似物：腺嘌呤类似物：2-ap; 6-mp 2-ap; 6-mp 1.诱变机制：诱变机制：2.碱基类似物的诱变处理方法碱基类似物的诱变处理方法2.1单独处理单独处理2.2 与辐射线复合处理与辐射线复合处理接种接种培养到对数期培养到对数期离心离心饥饿培养饥饿培养8-10h 加入加入5-bru，混匀，混匀(终浓度：终浓度：25-40ug/ml)平板涂布培养平板涂布培养使之诱变使之诱变挑单菌落挑单菌落筛选筛选二、烷化剂二、烷化剂1.定义：定义：生物学上的烷化剂是指在正常的生理条件下，生物学上的烷化剂是指在正常的生理条件下，能将其烷基转移给重要的生物大分子的一类

15、化合物。能将其烷基转移给重要的生物大分子的一类化合物。最早发现的烷化剂是最早发现的烷化剂是氮芥子气氮芥子气。2.烷化剂的种类：烷化剂的种类：根据分子中烷基的数目多寡，可将烷根据分子中烷基的数目多寡，可将烷化剂分为化剂分为单功能和双功能单功能和双功能的烷化剂两大类。的烷化剂两大类。已知广泛应用的有乙基璜酸乙脂已知广泛应用的有乙基璜酸乙脂(ees)、甲基璜酸乙脂、甲基璜酸乙脂(ems)、硫酸二乙脂、硫酸二乙脂(des)、亚硝基胍、亚硝基胍(ntg)，等。它们，等。它们有着良好的诱变效应。有着良好的诱变效应。3. 烷化剂的作用机制烷化剂的作用机制烷化剂主要是通过烷化基烷化剂主要是通过烷化基团团使使d

16、na分子上的碱基分子上的碱基及磷酸部分被烷化及磷酸部分被烷化，dna复制时导致碱基配复制时导致碱基配对错误而引起突变。对错误而引起突变。碱基中容易发生烷化的位碱基中容易发生烷化的位点。点。g-n7、g-o6、t-o4。3.1作用位点作用位点（1）对碱基的烷化作用）对碱基的烷化作用3.2 作用方式作用方式（2）引起）引起dna双链间的交联双链间的交联4. 烷化剂的性质烷化剂的性质烷化剂的性质比较活泼，在水溶液中容易发生水解。它们烷化剂的性质比较活泼，在水溶液中容易发生水解。它们大部分半衰期很短（与温度、溶液大部分半衰期很短（与温度、溶液ph关系很大）。关系很大）。烷化剂杀菌率低而诱变效应高；烷化

17、剂杀菌率低而诱变效应高；极毒！极毒！能致癌。能致癌。操作中应有防护措施，且操作中应有防护措施，且小心谨慎！避免接触身体及小心谨慎！避免接触身体及污染环境。污染环境。5.几种常用烷化剂几种常用烷化剂5.1 亚硝基胍（全称：亚硝基胍（全称：1-甲基甲基-3硝基硝基-1-亚硝基胍亚硝基胍 ntg）性质：性质： 黄色结晶，不溶于水，见光易分解。黄色结晶，不溶于水，见光易分解。有有超诱变剂超诱变剂之称。能使细胞发生一次或多次突之称。能使细胞发生一次或多次突变。还能使多基因并发突变。变。还能使多基因并发突变。诱变适合诱变适合ph值为值为6.0。诱变处理方法：诱变处理方法：菌体用缓冲液洗下制成菌体用缓冲液洗

18、下制成菌悬液菌悬液，离心，洗涤（浓度，离心，洗涤（浓度106107ml-1）配制配制ntg母液母液：配成：配成1mg/ml（比例：（比例：ntg丙酮溶液丙酮溶液1ml: 缓冲液缓冲液9ml）。使用时取母液）。使用时取母液0.2ml，加菌悬液，加菌悬液1.8ml。诱变处理：参考菌种和终浓度要求，将诱变处理：参考菌种和终浓度要求，将ntg加入菌悬液，加入菌悬液，保温保温一定时间（细菌一定时间（细菌2060min）。）。终止反应：用冷生理盐水终止反应：用冷生理盐水稀释稀释50倍倍以上。以上。后处理：低温后处理：低温离心洗涤离心洗涤除去药液，加无菌水悬浮并做成除去药液，加无菌水悬浮并做成一定稀释度一定

19、稀释度分离于平皿分离于平皿。或。或按一定浓度加后培养基于菌体按一定浓度加后培养基于菌体沉淀物中，振荡培养沉淀物中，振荡培养1.52h再稀释分离。再稀释分离。凡接触凡接触ntg的器皿必须及时、单独处理。的器皿必须及时、单独处理。5.2 甲基璜酸乙脂（又称乙基硫酸甲烷甲基璜酸乙脂（又称乙基硫酸甲烷 ems）性质：性质：无色液体难溶于水，不稳定，易水解挥发。无色液体难溶于水，不稳定，易水解挥发。 最佳诱变最佳诱变ph:7.07.4诱变处理方法诱变处理方法: 配制配制 0.5mol/l ems母液：预冷所需器皿，取母液：预冷所需器皿，取10mol/l ems原液原液0.5ml 加入加入9.5ml ph

20、 7.2 的磷酸缓冲液中，加盖封口。的磷酸缓冲液中，加盖封口。 制备菌悬液：培养菌体至对数期，离心洗涤，用缓冲液制制备菌悬液：培养菌体至对数期，离心洗涤，用缓冲液制成成 8ml 菌悬液（菌悬液（107108ml-1；孢子为；孢子为106107ml-1）。）。 诱变：取诱变：取ems母液母液 2ml 加入以上加入以上 8ml 菌悬液中（终浓度菌悬液中（终浓度为为 0.1 mol/l ；孢子为；孢子为 0.20.5 mol/l），处理一定时间（根），处理一定时间（根据预实验结果确定）。据预实验结果确定）。终止反应：终止反应：用用 50 倍生理盐水稀释或加入倍生理盐水稀释或加入2na2s2o3 ，多

21、次，多次离心洗涤。离心洗涤。5.3 硫酸二乙脂硫酸二乙脂 （des）性质：无色液体，不溶于水，很不稳定。最佳诱变性质：无色液体，不溶于水，很不稳定。最佳诱变 ph 7.2诱变处理方法：诱变处理方法： 2母液配制：取母液配制：取des原液原液 0.4ml 于灭菌试管中，加入少于灭菌试管中，加入少许乙醇使溶解，再加入许乙醇使溶解，再加入 ph 7.2磷酸缓冲液磷酸缓冲液 19.6 ml 。 菌悬液制备：用同一缓冲液将菌体洗下。菌悬液制备：用同一缓冲液将菌体洗下。 诱变处理：取以上诱变处理：取以上des溶液和菌悬液等量混合一定温度溶液和菌悬液等量混合一定温度下，振荡培养下，振荡培养2060min。

22、终止反应：终止反应：加入生理盐水稀释，或加入加入生理盐水稀释，或加入2 na2s2o3 0.5ml终止反应。终止反应。 后处理：将后处理：将 20ml 肉汤培养基加入菌体沉淀物中，培养肉汤培养基加入菌体沉淀物中，培养1.52h，然后稀释分离。，然后稀释分离。 三、脱氨剂（亚硝酸）三、脱氨剂（亚硝酸）1.诱变机制：诱变机制：亚硝酸可直接作用于正在复制或未复制的亚硝酸可直接作用于正在复制或未复制的 dna 分子，分子，氧化碱基中的氨基成酮基氧化碱基中的氨基成酮基，引起转换。还可引起，引起转换。还可引起 dna 双链间的交联。双链间的交联。2.诱变处理方法：诱变处理方法： 试剂配制：试剂配制： 处理过程：处理过程： 终止反应：终止反应： 后处理：后处理：四、移码诱变剂四、移码诱变剂1. 诱变机制：诱变机制：与与dna结合引起碱基增加或缺失而造成突结合引起碱基增加或缺失而造成突变。变。主要包括吖啶黄、吖啶橙、原黄素（主要包括吖啶黄、吖啶橙、原黄素（2 , 8 二氨基二氨基吖啶