细菌内毒素定量分析

1、细菌内毒素光度测定法试验讲义讲解 董光宴 1、光度测定法概述 2、试剂和仪器 3、标准曲线 4、干扰试验 5、检查法 湛江博康海洋生物有限公司一、光度测定法概述1 1、定量法的概念2、定量法的分类3、定量法的原理1 定量法的概念 光度测定法分为浊度法和显色基质法： 浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法。根据检测原理，可分为终点浊度法和动态浊度法。动态浊度法是检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。 定量法浊度法显色基质法动态浊度法终点浊度法2 定量法分类3 定量法的原理（1）动力学曲线：细菌内毒素与鲎试剂反应

2、过程中，随着反应的进行，混合物会逐渐变混浊，内毒素浓度越高浊度变化越快，浊度变化符合反应动力学曲线。（2）细菌内毒素含量与时间的关系：细菌内毒素浓度与反应时间分别取对数后，将两组数据用最小二乘法统计，可以得到直线：LgT=a+bLgC 我们将这条直线称为标准曲线。（3）、数学原理 原理：OD=-Lg（It/Io） 0.02=-Lg（It/Io） It=95%Io二 试剂和仪器光度测定法鲎试剂（生产单位：湛江博康海洋生物有限公司，批号：0907104，检测限：0.015EU/ml；规格为1.25ml/支）细菌内毒素检查用水（生产单位：湛江博康海洋生物有限公司，批号：0908030，规格：2ml/

3、支）细菌内毒素工作标准品（200966，120EU/支，中国药品生物制品检定所提供）氯化钾注射液（规格：1g/10ml 批号：0911211，生产厂家：河北某制药厂） 细菌内毒素定量检测仪（生产单位：天大天发科技有限，型号：BET-72）三 标准曲线1、制作标准曲线的条件2、标准曲线的选择3、标准曲线的制作4、标准曲线有效的条件5、结果分析1 制作标准曲线的条件l当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能会影响检验结果的改变时，需进行标准曲线的可靠性试验。l用标准内毒素配成溶液，并制成至少3个浓度的稀释液（相邻浓度间稀释倍数不得大于10），最低浓度不得低于所用鲎试剂的标示检测限。 2 标准曲

4、线的选择 制做标准曲线的内毒素浓度可选择10倍、5倍、4倍和2倍稀释的等比系列点，也可选择非等比系列点。一般情况下，我们不推荐10倍和2倍等比系列点，10倍等比系列点（如10EU/ml、1EU/ml、0.1EU/ml和0.01EU/ml）跨度大，其相关系数R和准确性都受到一定限制；2倍等比系列点（如0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml和0.06EU/ml）跨度太小，其相关系数R和准确性都较好，但很不实用。我们推荐选用4倍 等 比 系 列 点 （ 如 2 E U / m l 、 0 . 5 E U / m l 、0.125EU/ml和0.03EU/ml）跨度适中，其相关系数

5、R和准确性都较好，而且非常实用。3 标准曲线的制作3.1 内毒素标准品的溶解稀释 首先将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水1ml溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制备成2EU/ml、1EU/ml、0.5EU/ml、0.125EU/ml和0.03EU/ml备用。200EU/ml20EU/ml2.0EU/ml1.0EU/ml0.5EU/ml0.03EU/ml0.125EU/ml0.3ml0.3ml2.7ml2.7ml1.5ml1.5ml1.5ml1.5ml1.5ml1.5ml0.5ml0.5ml图 示3.2 定量法鲎试剂的溶解分装 将复溶好的光度测定法鲎试剂分装到14支定量分析专用试管中

6、，每管分装0.1ml。定量法鲎试剂定量试管每管0.1ml3.3 加 样 将内毒素加入定量分析专用试管中，每个浓度做3支平行管，剩下两管加入BET水作为阴性对照，每管加样量均为0.2ml 。2EU/ml0.5EU/ml0.125EU/ml0.03EU/mlBET水注：产品名称：注：产品名称：有机玻璃试管架 用 途：细菌内毒素检查定量法中用于摆放小试管。 特 点：有机玻璃材料可保护定量法小试管，避免定量法小试管被磨花而影响试验结果。3.4 检 测 加样完毕后用封口膜密封试管，将每支试管在旋涡混合器上点1-3秒，然后将试管对应插入已恒温的定量检测仪（37），仪器开始自动采集数据。注：封口膜封口膜的优

7、点规规 格：格：4IN35FT（4英寸35英尺）特特 点：点：进口代销 ，比较适合用于定量法专用试管的封口，清洗时不留任何残留物。 4 标准曲线有效的条件l当阴性对照的反应时间大于标准曲线最低浓度的反应时间，将全部数据进行线性回归分析。l根据线性回归分析，标准曲线的相关系数（r）的绝对值应该大于或等于0.980，试验方为有效。l平行管的变异系数10%。5 结果分析 内毒素 反应时间变异系数实测内毒素072000072002.07900.36%2.01182.07940.511591.01%0.50220.511400.12516200.34%0.12170.12516340.0323980.0

8、4%0.03180.032381 标准曲线：LogT=2.9783-0.2621LogC，相关系数：=-0.9999,标准曲线符合规定。四 干扰试验1、限值的确定2、干扰试验浓度的计算3、检测浓度的选择4、干扰试验溶液的制备5、供试品溶液的稀释6、干扰试验的制备方法7、干扰试验加样 8、判断的标准9、试验结果分析 10、结 论1 限值的确定 2010版中国药典二部正文1014页【氯化钾注射液】。L=0.12EU/mg2 干扰试验浓度的计算 按照中国药典2010年版提供的公式计算最大有效稀释倍数（注：其中标准曲线的最低点为0.015EU/ml）。 最大有效稀释倍数： MVD= CL/ =100

9、0.12/0.015 =800倍 3 检测浓度的选择 样品限值表达方式为EU/ml，直接选用其无干扰浓度并填写相应稀释倍数即可；样品限值表达方式为EU/mg ，无论其干扰情况如何，我们推荐以1mg/ml为初始浓度，选用其以下的无干扰浓度并填写从1mg/ml开始的相应稀释倍数，这样检测结果即为样品每ml或mg中内毒素的量。 我们将检测结果直接与限值比较即可。4 干扰试验溶液的制备编号内毒素浓度 被加入内毒素的溶液 平行管数A无1.0mg/ml或0.5mg/ml 至少2 B标准曲线的中点（或附近点）的0.5EU/ml（设为 m） 1.0mg/ml或0.5mg/ml 至少2 C2.0EU/ml、 0

10、.5EU/ml、 0.125EU/ml 、0.03EU/ml四个浓度 检查用水每一浓度至少2 D无检查用水至少2 5 供试品溶液的稀释 用细菌内毒素检查用水将氯化钾注射液稀释到2.0mg/ml、1.0mg/ml和0.5mg/ml备用。操作过程必须严格遵守无菌操作规程，保证无外源物质的干扰。 10.0mg/ml 2.0mg/ml1.0mg/ml 0.5mg/ml 0.3ml2.7ml1.0ml1.0ml0.3ml4.0ml1.0ml0.3ml100mg/ml 图 示6 干扰试验的制备方法 取氯化钾注射液的2.0mg/ml 、1.0mg/ml稀释液分别加入四支试管中，每管加0.3ml，然后分别吸取

11、0.3ml的内毒素标准溶液，浓度为1.0EU/ml按下图加入其中两支试管中，另外吸取0.3ml的检查用水加入其中另外两支试管中。将这四支管混合均匀即可得到氯化钾注射液的1.0mg/ml、0.5mg/ml稀释液干扰试验所需样品溶液。氯化钾注射液内毒素标准溶液1.0EU/ml0.3ml0.3ml0.3ml(2.0mg/ml)0.3ml(2.0mg/ml)0.3ml(1.0mg/ml)0.3ml(1.0mg/ml)BET水0.3ml0.3ml图 示7 干扰试验加样 取分装了0.1ml定量法鲎试剂的定量专用试管10支，每个浓度做2支平行管，氯化钾注射液的1.0mg/ml、0.5mg/ml稀释液干扰试验

12、各4支；另做2支阴性对照，每管加样量均为0.2ml。加样完毕后密封试管，将每支试管在旋涡混合器上点1-3秒，然后对应插入定量检测仪，仪器开始采集数据。 0.1ml鲎试剂0.1ml鲎试剂0.1ml鲎试剂1mg/ml的加样0.2ml0.2ml0.5mg/ml的加样0.2ml阴性对照图 示8 判断的标准 按所得线性回归方程分别计算供试品溶液和含标准内毒素的供试品溶液的内毒素含量Ct和Cs，再按下式计算该试验条件下的回收率（R）。 R=(CS-Ct)/m100%当内毒素的回收率在50%-200%之间，则认为在此该试验条件下供试品溶液不存在干扰作用。 图 示回收率： R=(CS-Ct)/m100%=10

13、0%9 试验结果分析样品氯化钾注射液干扰试验结果回收率R：以样品浓度C=1.0mg/ml（即稀释倍数为1)以9、10、11和12管为例，计算该浓度下的回收率（R）。 R=(CS-Ct)/m100% =（0.4654-0.0122）/0.5100% =90%注：如果检测结果小于检测限，计算回收率时以0计。 10 结 论 结论：依据2010版附录“细菌内毒素检查法”，氯化钾注射液细菌内毒素检查干扰试验1.0mg/ml和0.5mg/ml的稀释液符合试验要求，对鲎试验没有干扰。常规检查选用其中任一浓度即可。 五 检查法1 检测浓度的选择 如样品有干扰作用，选择符合干扰试验要求的第二个浓度作为日常检查的

14、浓度。2 试验有效条件试验必须符合以下三个条件方为有效： l标准曲线要符合 “可靠性试验”中的要求；l计算出的内毒素的回收率要在50%-200%的范围内；l阴性对照的反应时间应大于标准曲线最低浓度的反应时间。 3 结果判断 若供试品溶液所有平行管的平均内毒素浓度乘以稀释倍数后，小于规定的内毒素限值，判供试品符合规定。若大于或等于规定的内毒素限值，判供试品不符合规定。 六、光度测的特点1、定量仪器取值方法2、定量法的特点3、动态浊度法和凝胶法的比较浊度法取值法透光率反应时间取值法T0.95光密度反应时间取值法T0.02浊度反应时间取值法T501 定量仪器取值方法1.1 透光率反应时间取值法T0.

15、95 在鲎试验中，细菌内毒素浓度与反应达到某一状态的时刻有关，只要测出这一时间就可算出内毒素的实际浓度，这一过程叫反应时间取值方法。透光率反应时间取值法使用透光率描述鲎试剂的浊度变化。日本的ET-201型仪器采用该方法，即t0.95法。但该法所描述的透光率反应曲线与反应产物的量呈非线性关系。1.2 光密度反应时间取值法T0.02 光密度限值法预设一个光密度OD值，当反应曲线从开始上升到预设值时经理的时间作为反应时间，此方法的优点是时刻变化的OD值与反应产物的数量成正比，也就是吸光度变化曲线与凝胶产物的产生关系呈线性，取OD值上升0.02作为预设点，该点在反应曲线上的位置为浊度开始快速变化的时期

16、，该取值能够快速、稳定的获得反应时间。1.3 浊度反应时间取值法T50 浊度-时间曲线法每一管的浊度总是从0-1，这就是所谓“归一法”，这种动态浊度法必须求出浊度达到0.5的时间t50， t50与拐点极为接近，用该点代替拐点。 T50法很有优势，但要求每次鲎试验必须达到反应终点，否则无法获得终末透光强度，无法测得完整的浊度曲线，也就求不出t50。该法的缺点：耗时太长。2 定量法的特点（1）通过反应曲线，直观显示鲎试剂的反应过程；通过反应曲线，考察样品中的干扰。（2）快速、准确测到样品中的内毒素含量，有利于药品生产过程中的质量控制；可以检测临床病人体液中的内毒素含量，作为疾病诊断的依据。（3）操作简单、可靠性高。3 动态浊度法和凝胶法的比较项目动态浊度法凝胶法结果对结果的解释更慎重。有两倍的误差反应速度使用OD限值法，达到规定OD值即可结束试验。规定1小时。鲎试剂表 示制做标准曲线描述鲎试剂的检测能力，检测结果与最低检测限无关。用灵敏度复核试验来标定鲎试剂的灵敏度。项目动态浊度法凝胶