血清学试验苍松书屋

1、血清学诊断血清学诊断1深层分析血清学试验的概念血清学试验的概念u由于抗体主要存在于由于抗体主要存在于血清中，所以将体外血清中，所以将体外发生的抗原抗体结合发生的抗原抗体结合反应称为血清学反应反应称为血清学反应或血清学试验。或血清学试验。 2深层分析血清学试验的特点血清学试验的特点u特异性和交叉性 u敏感性 u可逆性 u反应的二阶段性 u最适比例与带现象 u用已知测未知 u 3深层分析特异性和交叉性特异性和交叉性u特异性特异性 抗原只能与相应抗体结合，而不能与其他抗体相结合。 u交叉性交叉性 两种不同的抗原之间含有共同的抗原决定簇，则发生交叉反应 。4深层分析反应的二阶段性反应的二阶段性 第二阶

2、段第二阶段 抗原抗体复合物出现可见反应阶段。此阶段反应慢、需数分钟、数十分钟或更久。第一阶段第一阶段 抗原与抗体的特异性结合阶段，此阶段反应快、仅数秒至数分钟，但不出现可见反应。5深层分析敏感性敏感性u抗原抗体的结合还具有高度敏感性的特点，不仅可检测定性，还可以定量检测微量、极微量的抗原或抗体。6深层分析最适比例与带现象最适比例与带现象v抗原与抗体结合，其比例适当时才可出现肉眼可见反应。抗体抗原与抗体结合，其比例适当时才可出现肉眼可见反应。抗体除除igm是是5价，价，siga 4价外，一般抗体都含有两个结合位点（二价外，一般抗体都含有两个结合位点（二价）；抗原则根据分子大小，有价）；抗原则根据

3、分子大小，有1050个不等的结合点。当抗个不等的结合点。当抗原抗体比例适当时，两者结合后，尚有未饱和的结合点，可以原抗体比例适当时，两者结合后，尚有未饱和的结合点，可以继续与游离的抗体、抗原或与抗原抗体结合物的未饱和点相联继续与游离的抗体、抗原或与抗原抗体结合物的未饱和点相联结，逐渐形成愈来愈大的复合物，出现了肉眼可见反应。比例结，逐渐形成愈来愈大的复合物，出现了肉眼可见反应。比例最适合，出现反应最快，反应产物愈多。最适合，出现反应最快，反应产物愈多。v如果抗原或抗体过多，抗体和抗原结合点的聚合一开始时即达如果抗原或抗体过多，抗体和抗原结合点的聚合一开始时即达到饱和，形成小的复合物则不能继续与

4、相邻抗原、抗体结合，到饱和，形成小的复合物则不能继续与相邻抗原、抗体结合，不出现可见反应，谓之带现象。不出现可见反应，谓之带现象。7深层分析前带前带 后后带带 8深层分析可逆性可逆性u抗原与抗体的结合是分子表面的结合，这种结合是可逆的，结合条件为040、ph49。如温度超过60或ph降到3以下，或加入解离剂时，则抗原抗体复合物又可重新解离，并且分离后抗原或抗体的性质仍不改变。9深层分析用已知测未知用已知测未知u所有的血清学试验都是用已知抗原测定未知抗体，或用已知抗体测定未知抗原。10深层分析影响血清学试验的因素影响血清学试验的因素u电解质：电解质：血清学反应须在适当浓度的电解质参与下，血清学反

5、应须在适当浓度的电解质参与下，才出现可见反应。才出现可见反应。0.9%0.9%氯化钠溶液。氯化钠溶液。8-10% 8-10% u温度：温度：在一定温度范围内，温度越高，抗原、抗体分在一定温度范围内，温度越高，抗原、抗体分子运动速度越快，这可以增加其碰撞的机会，加速抗子运动速度越快，这可以增加其碰撞的机会，加速抗原抗体结合和反应现象的出现原抗体结合和反应现象的出现 。11深层分析u酸碱度：酸碱度：血清学反应通常用血清学反应通常用ph6ph68 8，过酸或过碱都可使，过酸或过碱都可使复合物解离，复合物解离，phph值在等电点时，可引起非特异凝集。值在等电点时，可引起非特异凝集。 u振荡：振荡：适当

6、的机械振荡能增加分子或颗粒间的相互碰撞，适当的机械振荡能增加分子或颗粒间的相互碰撞，加速抗原抗体的结合反应，但强烈的振荡可使抗原抗体加速抗原抗体的结合反应，但强烈的振荡可使抗原抗体复合物解离。复合物解离。 u杂质和异物：杂质和异物：试验介质中如有与反应无关的杂质、异物试验介质中如有与反应无关的杂质、异物存在时，会抑制反应的进行或引起非特异性反应。存在时，会抑制反应的进行或引起非特异性反应。 u 12深层分析血清学试验的类型血清学试验的类型u凝集试验凝集试验 u沉淀试验沉淀试验 u补体结合试验补体结合试验 u中和试验中和试验 u免疫标记技术免疫标记技术13深层分析凝集试验的概念凝集试验的概念u细

7、菌、红细胞等颗粒性抗原，或吸附细菌、红细胞等颗粒性抗原，或吸附在红细胞、乳胶等颗粒性载体表面的在红细胞、乳胶等颗粒性载体表面的可溶性抗原，与相应抗体结合后，在可溶性抗原，与相应抗体结合后，在有适量电解质存在下，经过一定时间，有适量电解质存在下，经过一定时间，复合物互相凝聚形成肉眼可见的凝集复合物互相凝聚形成肉眼可见的凝集团块，称为凝集试验。团块，称为凝集试验。 14深层分析凝集试验的类型凝集试验的类型u直接凝集试验直接凝集试验 u间接凝集试验间接凝集试验 15深层分析直接凝集试验直接凝集试验概念：概念：颗粒性抗原与相应抗体在电解质的颗粒性抗原与相应抗体在电解质的参与下，直接结合，凝集成团的现象

8、，参与下，直接结合，凝集成团的现象，称直接凝集试验。称直接凝集试验。 类型：类型：按其操作方法可分为按其操作方法可分为玻片法玻片法和和试管试管法。法。 16深层分析1 1玻片凝集试验玻片凝集试验u方法：方法：在玻璃板或瓷在玻璃板或瓷片上进行。片上进行。 u特点：特点：简单、快速。简单、快速。 u用途：用途：定性试验，如定性试验，如细菌鉴定、血型鉴定细菌鉴定、血型鉴定等。等。17深层分析2 2试管凝集试验试管凝集试验u方法：方法：在试管中进行。在试管中进行。 u特点：特点：准确、耗时。准确、耗时。 u用途：用途：定量试验，如定量试验，如诊断布氏杆菌病，测诊断布氏杆菌病，测定抗体的凝集价。定抗体的

9、凝集价。18深层分析19深层分析v结果判定v结果用“+”表示反应强度。v+：液体完全透明，菌体完全被凝集呈伞状沉于管底。v+ ：液体透明，菌体基本被凝集沉于管底。v+ ：液体不甚透明，管底有明显的凝集沉淀。v+ ：液体透明度不明显或不透明，有不明显的沉淀或有沉淀的痕迹。v ：液体不透明，呈均匀混浊，管底无凝集。有时有少量菌体集中于管底中心，呈脐状，但振摇时，立即散开呈均匀浑浊。v以出现“+”的最高血清稀释倍数即为该份血清的效价，又叫凝集价。大动物（马，牛，骆驼等）以凝集价1：100以上判为阳性，1：50的凝集价判为可疑。中小动物（猪，羊，狗等）以凝集价1：50以上判为阳性，1：25的凝集价判为

10、可疑。v如对照管不符合要求时，试管须废弃重做。 20深层分析间接凝集试验间接凝集试验概念：概念： f将可溶性抗原或抗体将可溶性抗原或抗体与载与载体连接后，再与相应的抗体连接后，再与相应的抗体或抗原作用，所出现的体或抗原作用，所出现的特异性凝集反应为间接凝特异性凝集反应为间接凝集试验。集试验。类型：类型： f 间接血凝试验间接血凝试验 f 乳胶凝集试验乳胶凝集试验 f 协同凝集试验协同凝集试验21深层分析致敏红细胞致敏红细胞红细胞红细胞抗原抗原红细胞红细胞抗原抗原致敏红细胞致敏红细胞被检抗体被检抗体红细胞凝集红细胞凝集间接血凝试验原理间接血凝试验原理22深层分析23深层分析v凝集强度判定v （1

11、00%红细胞凝集）：边缘不整齐，有红色颗粒布满孔底）v （50%红细胞凝集）v型孔：孔底可见红色颗粒，中央有少量红细胞沉淀v 红细胞呈点状沉于孔底，无红色颗粒。v能使鸡红细胞完全凝集的病毒最高稀释倍数，为该病毒的红细胞凝集滴度，即一个凝集单位。如表18-1-1的病毒血凝滴度为27，即将病毒原液作27倍稀释，其中含一个血凝单位的病毒。v由于病毒血凝抑制试验中需要的病毒液应含4个血凝单位，因此，需要对原病毒液进行25倍稀释。24深层分析以能使100%红细胞不发生凝集的血清最大稀释倍数为该血清的hi滴度，以2的指数表示。 25深层分析沉淀试验的概念沉淀试验的概念u可溶性抗原与相应的抗体结合，在适量电

12、解质存在下，经过一定时间，形成肉眼可见的白色沉淀，称为沉淀试验。 26深层分析沉淀试验的类型沉淀试验的类型u环状沉淀试验环状沉淀试验 u琼脂凝胶扩散试验琼脂凝胶扩散试验 u免疫电泳免疫电泳27深层分析环状沉淀试验环状沉淀试验u方法：方法：在小口径试管中进行。在小口径试管中进行。 u原理：原理：试管内，下层沉淀素与试管内，下层沉淀素与上层沉淀原在液界面应形成白上层沉淀原在液界面应形成白色沉淀环。色沉淀环。 u用途：用途：主要用于抗原的定性试主要用于抗原的定性试验，如炭疽杆菌的验，如炭疽杆菌的ascoliascoli试验试验、链球菌的血清型鉴定、血迹鉴链球菌的血清型鉴定、血迹鉴定等。定等。白色沉淀

13、环白色沉淀环沉淀原沉淀原沉淀素沉淀素28深层分析琼脂凝胶扩散试验琼脂凝胶扩散试验u原理原理 1%1%琼脂凝胶孔径为琼脂凝胶孔径为85nm85nm，能使许多可溶性抗，能使许多可溶性抗原与抗体在凝胶中扩散。当抗原与抗体在凝原与抗体在凝胶中扩散。当抗原与抗体在凝胶中的一定位置上相遇时，则两者结合形成胶中的一定位置上相遇时，则两者结合形成沉淀线。沉淀线。29深层分析琼脂凝胶扩散试验类型琼脂凝胶扩散试验类型u单向单扩散单向单扩散 u单向双扩散单向双扩散 u双向单扩散双向单扩散 u双向双扩散双向双扩散 f方法方法 f用途用途 30深层分析双向双扩散方法双向双扩散方法u此法系采用1%琼脂倒于平皿或玻片上，制

14、成凝胶板，可按需要打孔。将抗原、抗体分别滴入孔内，放置湿盒中，在37c湿箱中24-72h后观察。31深层分析双向双扩散用途双向双扩散用途u u 抗原的比较和鉴定：抗原的比较和鉴定：在抗原在抗原与抗体孔间形成沉淀带。每与抗体孔间形成沉淀带。每一种抗原成分出现一条沉淀一种抗原成分出现一条沉淀带。如两个相邻孔之间抗原带。如两个相邻孔之间抗原相同，则沉淀带融合，如相同，则沉淀带融合，如1 1、2 2；抗原不同，则互相交叉，；抗原不同，则互相交叉，如如3 3；部分相同则部分融合，；部分相同则部分融合，另外不同部分则交叉，如另外不同部分则交叉，如4 4。32深层分析免疫电泳免疫电泳u免疫电泳技术是把凝胶扩

15、散试验与电泳技术相结合的免疫检测技术。即将琼脂扩散置于直流电场中进行，让电流来加速抗原与抗体的扩散并规定其扩散方向，在比例合适处形成可见的沉淀带。 33深层分析补体结合试验补体结合试验 u试验系统、试验系统、原理原理和结果判定和结果判定 反应系统反应系统已知抗原已知抗原（抗体）（抗体）待检血清待检血清（抗原）（抗原）补体补体绵羊红绵羊红细胞细胞溶血素溶血素如溶血则如溶血则为阴性为阴性如不溶血如不溶血则为阳性则为阳性指示系统指示系统反应结果的判定反应结果的判定34深层分析35深层分析中和试验中和试验u概念：概念：根据抗体能否中和病毒的感染性而建立的免根据抗体能否中和病毒的感染性而建立的免疫学试验

16、。疫学试验。 u原理：原理：病毒与抗血清中抗体特异结合后失去感染易病毒与抗血清中抗体特异结合后失去感染易感动物、鸡胚或细胞活性。感动物、鸡胚或细胞活性。 u举例举例 ibdvibdv 9 911d11d鸡胚鸡胚 242448h 48h 鸡胚死亡鸡胚死亡 ibdvibdv + +抗血清抗血清 9 911d11d鸡胚鸡胚 鸡胚不死亡鸡胚不死亡 36深层分析免疫标记技术免疫标记技术u抗原与抗体结合了，但复合物小，不能通过凝集或沉淀用肉眼观察到。 u将抗体或抗原联结在一个特定的易于检测的物质上，通过检测特定物质的存在，间接反映抗原抗体发生了结合。 37深层分析荧光抗体标记技术荧光抗体标记技术u原理：将

17、荧光色素标记在抗体或抗原上，与相应的抗原或抗体特异性结合后，用荧光显微镜观察所标记的荧光，以分析示踪相应的抗原或抗体的方法 。 u荧光素：荧光色素是能产生明显荧光，又能作为染料使用的有机化合物。最常用的是异硫氰酸荧光素(fitc)。38深层分析荧光抗体染色荧光抗体染色f染色方法染色方法 抗补体法抗补体法 直接法直接法 间接法间接法抗抗原原抗体抗体荧光素荧光素抗抗体抗抗体抗抗补补体体抗抗体体39深层分析酶标抗体技术酶标抗体技术u原理：将酶分子标记在抗体或抗原分子上，利用抗原抗体反应的特异性及酶的高催化活性进行检测。 u用于标记的酶：辣根过氧化物酶（hrp）、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。 u 40

18、深层分析f免疫酶组织化学染色技术 f酶联免疫吸附试验 f斑点-酶联免疫吸附试验酶标抗体技术分类酶标抗体技术分类41深层分析酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验u试验方法试验方法 f间接法：用于测定抗体 f夹心法：用于测定大分子抗原 f双夹心法：用于测定大分子抗原u原理原理 f通过化学方法将酶与抗体结合通过化学方法将酶与抗体结合起来。酶标记后的抗体仍然保起来。酶标记后的抗体仍然保持着能与相应抗原结合的免疫持着能与相应抗原结合的免疫学活性及酶的催化活性。酶标学活性及酶的催化活性。酶标抗体与抗原结合后，形成酶标抗体与抗原结合后，形成酶标抗体抗体-抗原复合物。复合物上的抗原复合物。复合物上的酶，在遇到相应的底物时，催酶，在遇到相应的底物时，催化底物分解，使底物中