第二章微生物的纯培养和显微技术

1、第二章第二章微生物的纯培养及显微技术微生物的纯培养及显微技术microbial pure cluture & the microscopic technique第一节第一节 微生物的分离和培养微生物的分离和培养培养物培养物（cluturecluture）：在一定条件下培养、繁殖得到的微：在一定条件下培养、繁殖得到的微生物群体生物群体 混合培养物混合培养物（mixed cluturemixed cluture）：含多种微生物的培养物；含多种微生物的培养物； 纯培养物纯培养物（pure cluturepure cluture）：只有一种微生物的培养物；：只有一种微生物的培养物； 纯培养技术

2、是进行微生物学研究的基础！纯培养技术是进行微生物学研究的基础！通常情况下只有纯培养物才能提供可以重复的结果通常情况下只有纯培养物才能提供可以重复的结果在研究中所使用的微生物培养群体：在研究中所使用的微生物培养群体： 无菌技术无菌技术 用固体培养基分离纯培养用固体培养基分离纯培养 用液体培养基分离纯培养用液体培养基分离纯培养 单细胞（单孢子）分离单细胞（单孢子）分离 选择培养分离选择培养分离 微生物的保藏技术微生物的保藏技术一、无菌技术一、无菌技术在转接、培养微生物室防止其他微生物的污染；在转接、培养微生物室防止其他微生物的污染；其自身不污染操作环境其自身不污染操作环境在分离、转接及培养纯培养在

3、分离、转接及培养纯培养(物物)时时防止其被其他微生物污染的技术。防止其被其他微生物污染的技术。用于分离、培养微生物的器皿事先不含任何微用于分离、培养微生物的器皿事先不含任何微生物；生物； 幻灯片 51、微生物培养的常用器具：试管、三角瓶、培养皿等2 2、保持无菌的方法、保持无菌的方法 高压蒸气灭菌（最常见）高压蒸气灭菌（最常见） 高温干热灭菌高温干热灭菌 棉塞棉塞 超净工作台超净工作台 无菌接种无菌接种高压灭菌锅高压灭菌锅接种操作接种操作火焰（酒精灯等）附近火焰（酒精灯等）附近 超净工作台超净工作台二、用固体培养基获得纯培养二、用固体培养基获得纯培养菌落（菌落（cloneycloney） 单个

4、（或聚集在一起的一团）微生物在适宜的固体单个（或聚集在一起的一团）微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体众多菌落连成一片众多菌落连成一片菌苔（菌苔（lawnlawn）各种微生物形成的菌落特征各种微生物形成的菌落特征同一细菌在不同培养基上形成不同菌落特征同一细菌在不同培养基上形成不同菌落特征平板分离微生物纯培养技术（原理及方法）平板分离微生物纯培养技术（原理及方法） 稀释倒平板法稀释倒平板法 涂布平板法涂布平板法 平板划线法平板划线法 稀释摇管法

5、稀释摇管法 1 1、稀释倒平板法（、稀释倒平板法（倾注平板法倾注平板法 pour plate methodpour plate method）u无菌水、梯度稀释、无菌水、梯度稀释、50-5550-55左右的琼脂培养基、灭过菌的培养左右的琼脂培养基、灭过菌的培养皿。注意要稀释得当。皿。注意要稀释得当。u分离出单个菌落以后，重复上述操作数次，便可得到纯培养。分离出单个菌落以后，重复上述操作数次，便可得到纯培养。十倍稀释法十倍稀释法优点：适合分离和计数目的优点：适合分离和计数目的局限：操作麻烦；局限：操作麻烦； 不合适热敏感菌；不合适热敏感菌； 不适合严格好氧菌；不适合严格好氧菌； 同一微生物，培养

6、基内外形成菌落形态差异同一微生物，培养基内外形成菌落形态差异2 2、涂布平板法（、涂布平板法（spread plate methodspread plate method）u无菌水、梯度稀释无菌水、梯度稀释u涂布平板涂布平板 liquid specimen is spread on the surface of solid agar with a sterile glass rod。 优点：简单易行；常规用法优点：简单易行；常规用法局限：涂布不均与；局限：涂布不均与； 易造成机械损伤易造成机械损伤稀稀释释倒倒平平板板法法& &涂涂布布平平板板法法3 3、平板划线法（、平板划线法

7、（streak plate methodstreak plate method）an inoculating loop is used to thin out organisms on the surface of the agar. 划线方法划线方法特点：快速、方便。特点：快速、方便。 分区划线（适用于分区划线（适用于浓度较大浓度较大的样品）的样品） 连续划线（适用于连续划线（适用于浓度较小浓度较小的样品）的样品）厌氧罐厌氧罐4 4、厌氧微生物的分离、厌氧微生物的分离厌氧手套箱厌氧手套箱密封容器除氧方法密封容器除氧方法u生物方法生物方法 与需氧微生物共同培养与需氧微生物共同培养u物理方法物理

8、方法抽气法抽气法将培养物置真空干燥器中抽真空，再将培养物置真空干燥器中抽真空，再培养。培养。充气法充气法把培养物放一密闭贮器中充入把培养物放一密闭贮器中充入n n2 2（排（排尽空气）尽空气）u化学方法化学方法化学吸氧法化学吸氧法利用化学反应耗氧达到形成厌氧环利用化学反应耗氧达到形成厌氧环境的目的。境的目的。用焦性没食子酸（用焦性没食子酸（1g1g）与）与naohnaoh（10%10%）反应除氧（）反应除氧（100ml100ml空气中的空气中的o o2 2）。）。密闭容器中利用硫磺或磷的燃烧耗氧形成厌氧环境密闭容器中利用硫磺或磷的燃烧耗氧形成厌氧环境nahsonahso3 3+naco+nac

9、o3 3混和反应耗氧混和反应耗氧培养基预还原法培养基预还原法 培养基中加入还原剂（半胱氨酸、培养基中加入还原剂（半胱氨酸、nana2 2s s、vcvc）再隔）再隔绝空气培养，适于培养专性厌氧菌。绝空气培养，适于培养专性厌氧菌。稀释摇管法（稀释摇管法（shake tube method)shake tube method) 用于分离严格厌氧菌用于分离严格厌氧菌。试管培养基融化。试管培养基融化 50 50 保温保温 样品梯度稀释后加入试管培养基中样品梯度稀释后加入试管培养基中 摇摇匀冷却凝固匀冷却凝固 石蜡油封闭石蜡油封闭 培养。培养。特点：严格厌氧菌分离技术；特点：严格厌氧菌分离技术； 适用缺

10、乏专业设备的情况适用缺乏专业设备的情况局限：观察和挑取菌落难局限：观察和挑取菌落难三、用液体培养基获得纯培养三、用液体培养基获得纯培养u用于细胞大的细菌、原生动物和藻类等的纯化分离。用于细胞大的细菌、原生动物和藻类等的纯化分离。u稀释法稀释法：经高度稀释后，同一个稀释度的试管中大多数（：经高度稀释后，同一个稀释度的试管中大多数（95%95%以上）表现不生长，很可能得到的是纯培养。以上）表现不生长，很可能得到的是纯培养。 四、显微单细胞（单孢子）分离法四、显微单细胞（单孢子）分离法u适合混合菌中的少数菌；适合混合菌中的少数菌；u一般采用显微操作仪，在显微镜下进行；一般采用显微操作仪，在显微镜下进

11、行；u操作难度与细胞或个体大小成反比操作难度与细胞或个体大小成反比毛细管法：毛细管法：用毛细管提取微生物个体，适合于较大微用毛细管提取微生物个体，适合于较大微生物。生物。显微操作仪：显微操作仪：用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢子以获得纯培养。子以获得纯培养。小液滴法：小液滴法：将经适当稀释后的样品制成小液滴，在显将经适当稀释后的样品制成小液滴，在显微镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物分离微镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物分离五、选择培养分离五、选择培养分离 当微生物群落中数量占少数的微生物的分离纯化当微生物群落中数量占少数的微生物的分离纯化使待

12、分离的微生物在群落中数量上升，方便使待分离的微生物在群落中数量上升，方便用稀释法对其进行纯化用稀释法对其进行纯化使待分离的微生物生长使待分离的微生物生长“突出突出”直接挑取待分离的微生物的菌落获得纯培养直接挑取待分离的微生物的菌落获得纯培养抑制大多数其他微生物的生长；抑制大多数其他微生物的生长；使待分离的微生物生长更快；使待分离的微生物生长更快；高温条件下分离高温菌；培养基添加抗生素，分离抗性菌；培养基中不含n，分离固氮菌1 1、利用选择平板进行直接分离、利用选择平板进行直接分离 2 2、富集培养、富集培养主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同，制主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同

13、，制定特定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物旺盛定特定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，人们能够生长，从而使其在群落中的数量大大增加，人们能够更容易地从自然界中分离到所需的特定微生物更容易地从自然界中分离到所需的特定微生物 如果要从环境中分离得到仅能够利用苯作为碳源如果要从环境中分离得到仅能够利用苯作为碳源和能源的微生物纯培养物，你该如何设计实验方和能源的微生物纯培养物，你该如何设计实验方案？案？（1 1）富含苯采样）富含苯采样（2 2）十倍稀释）十倍稀释（3 3）培养（富集或直接筛选）培养（富集或直接筛选）（4 4）对照培养（利用空气中的）对照培

14、养（利用空气中的coco2 2的自养型微生物）的自养型微生物）二元培养物二元培养物 纯培养物：只有一种微生物的培养物。纯培养物：只有一种微生物的培养物。 混合培养物：含有两种以上微生物的培养混合培养物：含有两种以上微生物的培养物。物。 二元培养物：只含两种微生物且有意识地二元培养物：只含两种微生物且有意识地保持二者之间特定关系的培养物。保持二者之间特定关系的培养物。 病毒和宿主细胞病毒和宿主细胞六、微生物的保藏技术六、微生物的保藏技术 影响微生物菌种稳定性的因素： a）变异 b）污染 c）死亡 基本要求： 在一定时间内使菌种不杂、不乱、不衰、不退基本原理：基本原理： 菌种：优良纯种（最好是休眠

15、体）菌种：优良纯种（最好是休眠体） 手段：低温、缺氧、缺乏营养、添加保护剂等手段：低温、缺氧、缺乏营养、添加保护剂等 环境：生长受到抑制，难以突变环境：生长受到抑制，难以突变1 1、传代培养保藏法传代培养保藏法 是微生物保存的基本方法。是微生物保存的基本方法。 琼脂斜面、半固体琼脂柱和液体培养等。琼脂斜面、半固体琼脂柱和液体培养等。 橡皮塞封口或用石蜡覆盖，并放置低温保存橡皮塞封口或用石蜡覆盖，并放置低温保存 4-64-6保存。保存。斜面低温保藏法斜面低温保藏法 原理：低温原理：低温方法：将菌种接种在新鲜斜面培养基上方法：将菌种接种在新鲜斜面培养基上适温培养至适温培养至生长完全生长完全44冰箱

16、保藏冰箱保藏每隔一段时间移接一次每隔一段时间移接一次 优点：优点：适用于各种微生物；简便易行；易于观察；适用于各种微生物；简便易行；易于观察； 缺点：保藏时间短；传代缺点：保藏时间短；传代次数多；易变异；次数多；易变异；易污染、易污染、 保藏时间：保藏时间： 霉霉 4 4个月个月 酵酵 4646个月个月 放放 3 3个月个月 细细 1212个月个月改良方法：橡皮塞改良方法：橡皮塞取代棉塞、加矿油取代棉塞、加矿油2 2、石蜡油封藏法石蜡油封藏法原理：低温、缺氧原理：低温、缺氧 方法：将无菌石蜡油注入生长良好的斜面种试管方法：将无菌石蜡油注入生长良好的斜面种试管内（油量高出斜面内（油量高出斜面1c

17、m1cm）包扎后竖直放入冰箱保藏。包扎后竖直放入冰箱保藏。说明：说明：保藏时间保藏时间1212年；年；斜面培养基能干燥则保藏效果好；斜面培养基能干燥则保藏效果好；适于各种微生物，尤其适合丝状真菌和担子菌适于各种微生物，尤其适合丝状真菌和担子菌能同化和敏感烃类的微生物不宜用此法。能同化和敏感烃类的微生物不宜用此法。3 3、砂土管保藏法（干燥砂土管保藏法（干燥- -载体保藏）载体保藏）原理：干燥、缺氧原理：干燥、缺氧方法：取河砂若干，方法：取河砂若干，2424目过筛目过筛10%hcl10%hcl浸泡浸泡24h24h水水洗至中性洗至中性烘干后分装安瓿瓶或试管，加棉塞烘干后分装安瓿瓶或试管，加棉塞灭菌

18、灭菌无菌检查无菌检查每管加孢子悬液，接种环拌匀每管加孢子悬液，接种环拌匀干燥器干燥器中干燥中干燥火焰熔封或蜡封火焰熔封或蜡封干燥器中保藏干燥器中保藏说明：说明：适于保藏霉菌和放线菌孢子及芽孢杆菌适于保藏霉菌和放线菌孢子及芽孢杆菌时间时间210210年年一般细菌芽孢常用砂土管保藏，霉菌的孢子多用麸皮管保藏。一般细菌芽孢常用砂土管保藏，霉菌的孢子多用麸皮管保藏。一般细菌芽孢常用砂土管保藏，霉菌的孢子多用麸皮管保藏。一般细菌芽孢常用砂土管保藏，霉菌的孢子多用麸一般细菌芽孢常用砂土管保藏，霉菌的孢子多用麸皮管保藏。皮管保藏。4 4、液氮超低温保藏法（冷冻保藏法）液氮超低温保藏法（冷冻保藏法）原理：低温

19、原理：低温方法：将菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超方法：将菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超低温冰箱中（低温冰箱中（ -196-196）。）。优点：适用于各种微生物的较理想的保藏方法。优点：适用于各种微生物的较理想的保藏方法。缺点：缺点：专门的设备；运输过程比较麻烦；操作要求专门的设备；运输过程比较麻烦；操作要求5 5、真空冷冻干燥法真空冷冻干燥法原理：低温、干燥、真空（缺氧）原理：低温、干燥、真空（缺氧）方法：将菌种用保护剂制成菌悬液，先在极低温度下方法：将菌种用保护剂制成菌悬液，先在极低温度下快速冷冻，再在极低的温度下抽真空干燥，使其中快速冷冻，再在极低的温度下抽真空干燥，使其中的水

20、分直接升华为水蒸汽，以达干燥的目的。的水分直接升华为水蒸汽，以达干燥的目的。常用的细胞保护剂：血清、脱脂牛奶、淀粉、葡聚糖常用的细胞保护剂：血清、脱脂牛奶、淀粉、葡聚糖优点：适用各种微生物；便于大量保藏；可避免污染优点：适用各种微生物；便于大量保藏；可避免污染 变异率低；菌种存活时间长（几到几十年）变异率低；菌种存活时间长（几到几十年） 缺点：操作过程复杂，需要一定的专业设备缺点：操作过程复杂，需要一定的专业设备 几种常用菌种保藏方法的比较几种常用菌种保藏方法的比较：广泛收集科研和生产菌种、菌株，并加以妥善保管，使之达到不死、不衰、不乱以及便于研究、交换和使用的目的。： 中国微生物菌种保藏委员

21、会(ccccm) 美国的典型菌种保藏中心(atcc) 英国国家典型菌种保藏所（nctc） 法国里昂巴斯德研究所（ipl）国内外菌种保藏机构国内外菌种保藏机构七、菌种的衰退与复壮七、菌种的衰退与复壮1 1、菌种的衰退、菌种的衰退 衰退（衰退（degenerationdegeneration）：）：菌种在培养或保藏过程菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退。种的衰退。 常见的衰退现象：常见的衰退现象： 菌落和细胞形态的改变；生长速度缓慢，产孢

22、子菌落和细胞形态的改变；生长速度缓慢，产孢子越来越少；抵抗力、抗不良环境能力减弱；代谢越来越少；抵抗力、抗不良环境能力减弱；代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降等产物生产能力或其对宿主寄生能力下降等2 2、衰退的原因、衰退的原因基因突变，基因突变，分离现象分离现象3 3、防止菌种衰退的方法、防止菌种衰退的方法采用不同类型的细胞进行传代采用不同类型的细胞进行传代（对丝状微生物而言，通常采用稳定的单核孢子进行接种）选择合适的培养条件选择合适的培养条件控制传代次数控制传代次数（一般在dna的复制过程中，碱基的错配率是5x10-4，自发突变的频率为10-810-9，采用良好的菌种保藏方法，可以减少移

23、种和传代的次数）采用有效的菌种保藏方法采用有效的菌种保藏方法4 4、 菌种的复壮（菌种的复壮（rejuvenationrejuvenation） 使衰退的菌种恢复原来优良性状。使衰退的菌种恢复原来优良性状。是指在菌种已发生衰退的情况下，通是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施；型性状的措施；是指在菌种的生产性能未衰退前就有是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工意识的经常、进行纯种的分离和

24、生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。作，以期菌种的生产性能逐步提高。 菌种的复壮措施：菌种的复壮措施：纯种分离纯种分离（平板划线法、涂布法、倾注法、单细（平板划线法、涂布法、倾注法、单细胞挑取法等）胞挑取法等）通过寄主体内生长进行复壮通过寄主体内生长进行复壮（如（如bacillus bacillus thuringiensisthuringiensis的复壮）的复壮） ； 淘汰已衰退的个体淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进行处理，以杀死生命力较差的已衰退个体）采用有效的菌种保藏方法采用有效的菌种保藏方法第二节第二节 显微镜的种类及显微技术显微镜的种类及显微技术 （了解）（了解

25、） 显微镜的种类及原理显微镜的种类及原理 显微观察样品的制备显微观察样品的制备 一、显微镜的种类及原理一、显微镜的种类及原理 普通光学显微镜普通光学显微镜 暗视野显微镜暗视野显微镜 相差显微镜相差显微镜 荧光显微镜荧光显微镜 透射电子显微镜透射电子显微镜 扫描电子显微镜扫描电子显微镜 扫描隧道显微镜扫描隧道显微镜 光学显微镜u原理 利用物镜和目镜的多组凸透镜将物象逐渐放大并放射到视网膜的过程分辨率分辨率n肉眼分辨率一般只有肉眼分辨率一般只有0.25mmn光学显微镜分辨率光学显微镜分辨率0.18mn电子显微镜可达电子显微镜可达0.2nmnd=0.5 /sinn （）（）n式中：式中：n=介质折射

26、率；介质折射率；=镜口角（标本对镜口角（标本对物镜镜口的张角），物镜镜口的张角），sin =镜口率镜口率普通生物显微镜由三部分构成：普通生物显微镜由三部分构成：机械装置：保证光学系统的准确配制，用于固机械装置：保证光学系统的准确配制，用于固定材料和观察方便。定材料和观察方便。照明系统：包括光源和聚光器。照明系统：包括光源和聚光器。光学放大系统：由物镜和目镜组成，是显微镜光学放大系统：由物镜和目镜组成，是显微镜的主体，为了消除球差和色差，目镜和物镜都的主体，为了消除球差和色差，目镜和物镜都由复杂的透镜组构成。由复杂的透镜组构成。二、实验原理机械机械装置装置光学光学装置装置聚光器聚光器聚光器透镜聚

27、光器透镜虹彩光圈虹彩光圈升降螺旋升降螺旋显微镜的放大倍数：物镜放大倍数显微镜的放大倍数：物镜放大倍数目镜放大倍数目镜放大倍数显微镜使用的方法原因分析要观察的标本不在视野内要观察的标本不在视野内调整玻片位置调整玻片位置物镜头与玻片标本间的距离大物镜头与玻片标本间的距离大于或小于低（高）倍镜的工作于或小于低（高）倍镜的工作距离距离重新调节焦距重新调节焦距标本太小标本太小需用推进器反复找需用推进器反复找或更换标本或更换标本标本的颜色浅或透明标本的颜色浅或透明调节聚光镜或光圈，调节聚光镜或光圈，使视野变暗使视野变暗明视野显微镜明视野显微镜 明视野显微镜即常用的普通光学显微镜，明视野显微镜即常用的普通光

28、学显微镜， 生活的细菌在明视野显微镜下观察是透明的，生活的细菌在明视野显微镜下观察是透明的，不易看清。不易看清。 解决的措施，一方面是对观察的样品进行改造解决的措施，一方面是对观察的样品进行改造，发展出各种染色技术，通过特殊的染色方法使细，发展出各种染色技术，通过特殊的染色方法使细胞着色，增加与背景的反差，便于观察；另一方面胞着色，增加与背景的反差，便于观察；另一方面进行显微镜的改造，由此发展出不同种类的显微镜进行显微镜的改造，由此发展出不同种类的显微镜，适用于不同的观察目的。，适用于不同的观察目的。2 2、暗视野显微镜、暗视野显微镜 暗视野显微镜是应用了特殊聚光器，暗视野显微镜是应用了特殊聚

29、光器，只允许被只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。是黑的，物体的边缘是亮的。应用：生活细菌运动性观察。应用：生活细菌运动性观察。 特点特点: : 只能看到物体的存在与运动，不能辨清其只能看到物体的存在与运动，不能辨清其微细结构。微细结构。3 3、相差显微镜、相差显微镜光波的长短表现为颜色差别，光的振幅高低表现光波的长短表现为颜色差别，光的振幅高低表现为明亮程度的不同。观察样品各部分厚薄、密度不为明亮程度的不同。观察样品各部分厚薄、密度不同，光线通过时直射光和衍射光的光程产生差别，同，光线通过时直射光和衍射光的

30、光程产生差别，导致出现相位差。导致出现相位差。相差显微镜配备了特殊的光学装置，利用光的干相差显微镜配备了特殊的光学装置，利用光的干涉现象，将光的相位差转变成人眼可辨的振幅差（涉现象，将光的相位差转变成人眼可辨的振幅差（明暗差），形成反差，从而提高了各种结构间的对明暗差），形成反差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。比度，使各种结构变得清晰可见。应用：观察活的细胞以及细胞内的一些细微结构应用：观察活的细胞以及细胞内的一些细微结构4 4、荧光显微镜、荧光显微镜紫外线光源照射在具有荧光素的样本上，激发出荧紫外线光源照射在具有荧光素的样本上，激发出荧光，使标本在暗的视野中显现出光亮

31、的物体，光，使标本在暗的视野中显现出光亮的物体，不同的荧光素还表现为不同的颜色，由此可以进行不同的荧光素还表现为不同的颜色，由此可以进行定性和定量的研究。定性和定量的研究。应用：生物组织、生理、病理、微生物、医药、食应用：生物组织、生理、病理、微生物、医药、食品、化学等诸方面的鉴定等品、化学等诸方面的鉴定等电子显微镜与光学显微镜的差异：电子显微镜与光学显微镜的差异：1） 以电子波以电子波(波长最短可达到波长最短可达到0.005 nm)代代替光源，电镜实际的分辨率比光镜提高约替光源，电镜实际的分辨率比光镜提高约1000倍。倍。2）电镜镜筒中要求高真空。所以很难观察活）电镜镜筒中要求高真空。所以很

32、难观察活的生物。的生物。3）以电子透镜（电磁圈）代替光学透镜，）以电子透镜（电磁圈）代替光学透镜，4）电子像人肉眼看不到，需用荧光屏来显示）电子像人肉眼看不到，需用荧光屏来显示或感光胶片作记录。或感光胶片作记录。 电子显微镜按结构和用途可分为：电子显微镜按结构和用途可分为： 透射电子显微镜透射电子显微镜(transmission electron microscope): 电子束穿过薄切片电子束穿过薄切片 扫描电子显微镜扫描电子显微镜(scanning electron microscope): 观察样品的表面结构观察样品的表面结构 二、显微观察样品的制备二、显微观察样品的制备 u要根据显微镜

33、和样品的特点来制备要根据显微镜和样品的特点来制备u主要讲述光学显微镜的制样。主要讲述光学显微镜的制样。 1、活体观察、活体观察 压滴法：将菌悬液滴于载玻片上，加盖盖玻片后立压滴法：将菌悬液滴于载玻片上，加盖盖玻片后立即进行显微镜观察。即进行显微镜观察。 悬滴法：在盖玻片中央加一小滴菌悬液后反转置于悬滴法：在盖玻片中央加一小滴菌悬液后反转置于特制的凹载玻片上后进行显微镜观察，为防止液滴特制的凹载玻片上后进行显微镜观察，为防止液滴蒸发变干，一般还应在盖玻片四周加封凡士林。蒸发变干，一般还应在盖玻片四周加封凡士林。 菌丝埋片法：将无菌小块玻璃纸铺于平板表面，涂菌丝埋片法：将无菌小块玻璃纸铺于平板表面

34、，涂布放线菌或霉菌孢子悬液，经培养，取下玻璃纸置布放线菌或霉菌孢子悬液，经培养，取下玻璃纸置于载玻片上，用显微镜对菌丝的形态进行观察。于载玻片上，用显微镜对菌丝的形态进行观察。 插片法：插片法： 2 2、染色观察、染色观察 固定的目的：固定的目的： 杀死细菌并使菌体粘附于玻片上。杀死细菌并使菌体粘附于玻片上。 增加细菌对染料的亲和力。增加细菌对染料的亲和力。 常用的方法有酒精灯火焰加热和化学固定二种常用的方法有酒精灯火焰加热和化学固定二种细菌细菌染色法染色法死菌死菌正染色正染色负染色：荚膜染色法等负染色：荚膜染色法等简单染色法简单染色法鉴别染色法鉴别染色法革兰氏染色法革兰氏染色法抗酸性染色法抗

35、酸性染色法芽芽 孢孢 染染 色色 法法姬姆萨染色法姬姆萨染色法活菌活菌: 用美蓝或用美蓝或ttc（氯化三苯基四氮唑）（氯化三苯基四氮唑）等作活菌染色等作活菌染色染色观察染色观察滴加少量水滴加少量水挑取菌体挑取菌体涂片涂片干燥干燥固定固定染色染色水洗水洗干燥干燥第三节第三节 显微镜下的微生物显微镜下的微生物 原核微生物指细胞核无核膜、无核仁，没有染色体，不进行有丝分裂的微生物。 真核微生物指具有完整的细胞核、有核仁、核膜、染色体，能进行有丝分裂的微生物。一、细菌和古生菌 定义：细菌是一类细胞细而短（细胞直径约0.5um，长度约0.55um）、结构简单、细胞壁坚韧、以二等分裂方式繁殖和水生性较强的

36、原核微生物。 生存环境：温暖潮湿、富含有机物的地方，都有大量细菌活动。有特殊的臭味或酸败味，发粘、发滑。1 1、细细菌菌的的形形态态和和排排列列（1）球菌 形状：球形（独存）或近似球形（几个连在一起，稍扁） 大小：0.51m 分裂与排列：单球菌单球菌细胞分裂沿一细胞分裂沿一个平面进行，个平面进行，新个体分散而新个体分散而单独存在单独存在. .如尿素微球菌如尿素微球菌( (micrococcus micrococcus ureae)ureae)细胞沿一个平面分裂，新个细胞沿一个平面分裂，新个体成对排列体成对排列. . 如肺炎双球菌如肺炎双球菌 ( (diplococcus pneumoniae)

37、 )双球菌双球菌细胞沿一个平面进行分裂，新细胞沿一个平面进行分裂，新个体不但可保持成对的样子，个体不但可保持成对的样子，并可连成链状并可连成链状. .如：乳链球菌如：乳链球菌 （streptococcus lactisstreptococcus lactis）无乳链球菌（无乳链球菌（streptococcus streptococcus agalactiae)agalactiae)溶血链球菌溶血链球菌 （ streptococcus streptococcus hemolyticus)hemolyticus)链球菌链球菌细胞分裂是沿两个相垂直的平细胞分裂是沿两个相垂直的平面进行，分裂后每四个细

38、胞特面进行，分裂后每四个细胞特征性地连在一起，呈田字形征性地连在一起，呈田字形. .如四联微球菌如四联微球菌 （micrococcus tetragenusmicrococcus tetragenus）四联球菌四联球菌细胞按三个互相垂直的平细胞按三个互相垂直的平面进行分裂后，每八个球面进行分裂后，每八个球菌特征性地连在一起成立菌特征性地连在一起成立方体形方体形. . 如藤黄八叠球菌如藤黄八叠球菌 （sarcina ureaesarcina ureae) )八叠球菌八叠球菌细胞无定向分裂，多细胞无定向分裂，多个新个体形成一个不个新个体形成一个不规则的群体，犹如一规则的群体，犹如一串葡萄。串葡萄。

39、如金黄色葡萄球菌如金黄色葡萄球菌（staphylococcus staphylococcus aureus)aureus)白色葡萄球菌白色葡萄球菌（staphylcoccus staphylcoccus albus)albus)葡萄球菌葡萄球菌杆菌是细菌中种类最多的类型杆菌是细菌中种类最多的类型, ,因菌种不同因菌种不同, ,菌体细胞菌体细胞的长短、粗细等都有所差异。的长短、粗细等都有所差异。杆菌的形态：杆菌的形态：短杆状、长杆状、棒杆状、梭状杆状、短杆状、长杆状、棒杆状、梭状杆状、月亮状、竹节状等；月亮状、竹节状等；短杆菌短杆菌（2 2）杆菌）杆菌( (bacillusbacillus) )

40、及其排列状态及其排列状态大肠杆菌大肠杆菌长杆菌长杆菌梭状芽孢杆菌梭状芽孢杆菌 大小：15m0.5m 形状：主要杆状或圆柱形。 其它：青烟状、弧状、胡萝卜状、大脑骨状、分枝状、丝状 分裂：二分分裂； 折断分裂断面不规则，子细胞大小不一； 出芽分裂 排列：链状；栅栏状；八”字状；分散随机排列bacterial shape链状链状 2）杆菌的排列状态）杆菌的排列状态x, v x, v 或或 y y型型栅栏状栅栏状3）杆菌端部特征）杆菌端部特征-1 大肠杆菌大肠杆菌(钝圆钝圆)肉毒梭菌肉毒梭菌(梭状梭状)炭疽杆菌（平截）炭疽杆菌（平截）杆菌是细菌中种类最多的，工农业生产中所用杆菌是细菌中种类最多的，工

41、农业生产中所用的细菌大多是杆菌，如淀粉酶、蛋白酶生产菌的细菌大多是杆菌，如淀粉酶、蛋白酶生产菌- - -枯草杆菌，谷氨酸生产菌枯草杆菌，谷氨酸生产菌-北京棒杆菌，细菌北京棒杆菌，细菌肥料肥料-根瘤菌，杀虫剂根瘤菌，杀虫剂-苏云金杆菌，致病菌苏云金杆菌，致病菌- - -伤寒沙门氏菌，痢疾志贺氏菌等。伤寒沙门氏菌，痢疾志贺氏菌等。（3 3）螺旋菌）螺旋菌(spirilla)(spirilla)螺旋状的细菌称为螺旋菌。螺旋状的细菌称为螺旋菌。根据其弯曲情况分为：根据其弯曲情况分为：弧菌（弧菌（vibrio)vibrio)：螺旋不满一圈，菌体呈弧形或逗号形螺旋不满一圈，菌体呈弧形或逗号形 例：霍乱弧菌

42、、逗号弧菌例：霍乱弧菌、逗号弧菌螺旋菌螺旋菌(spirillum)(spirillum)：螺旋满螺旋满2 26 6环，螺旋状环，螺旋状 例：干酪螺菌例：干酪螺菌 螺旋体螺旋体(spirochaeta)(spirochaeta)：旋转周数在旋转周数在6 6环以上，菌体柔环以上，菌体柔软。软。 例：梅毒密螺旋体例：梅毒密螺旋体vibrio cholerae4.特殊形状的细菌特殊形状的细菌柄细菌、肾形菌、臂微菌、网格硫细菌、柄细菌、肾形菌、臂微菌、网格硫细菌、贝日阿托氏菌贝日阿托氏菌( (丝状丝状) )、具有子实体的粘细、具有子实体的粘细菌等是特殊形态的细菌菌等是特殊形态的细菌。粘细菌柄细菌臂微菌肾

43、形菌网格硫细菌贝日阿托氏菌培养时间、培养温度、培养时间、培养温度、培养基成分、浓度、培养基成分、浓度、ph值值结核杆菌的正常形态结核杆菌的正常形态结核杆菌的异常形态结核杆菌的异常形态（二）细菌的大小（二）细菌的大小(1)测量：测微尺测量：测微尺(2)长度单位：微米长度单位：微米(m)(3)表示：表示： 球菌：直径球菌：直径 杆菌：宽杆菌：宽长长 螺菌：宽、长、螺距螺菌：宽、长、螺距通常通常球菌直径球菌直径：0.2 0.2 1.51.5 mm， 杆菌杆菌: :长长1 1 5m, 5m, 宽宽0.50.51m1m。例如：例如：e.colie.coli：平均长度：平均长度：2 m 2 m ； 宽度宽

44、度0.5m0.5m 1500 1500个大肠杆菌头尾相接等于个大肠杆菌头尾相接等于3mm;3mm; 10 109 9个大肠杆菌重个大肠杆菌重1 mg.1 mg.细菌大小举例2 2、古生菌（自学）、古生菌（自学） 与细菌有着类似的个体形与细菌有着类似的个体形态，但多生活在极端环境态，但多生活在极端环境中如高温、高盐等。中如高温、高盐等。二、真菌二、真菌 霉菌霉菌 酵母菌酵母菌 1 1 霉菌霉菌(molds)(molds)霉菌霉菌(mould)(mould)是一些丝状真是一些丝状真菌的通称，并不是分类学上菌的通称，并不是分类学上的名称。在自然界分布很广。的名称。在自然界分布很广。大量存在于中性或偏

45、酸性土大量存在于中性或偏酸性土壤中。壤中。概念概念分类位置分类位置分布分布应用应用危害危害1、霉菌、霉菌 霉菌即丝状真菌，有分枝与不分枝、无隔菌丝（霉菌即丝状真菌，有分枝与不分枝、无隔菌丝（根霉、毛霉）与有隔菌丝（青霉、曲霉）之分。根霉、毛霉）与有隔菌丝（青霉、曲霉）之分。 n菌丝体：由许多菌丝交织在一起而组成。菌丝体：由许多菌丝交织在一起而组成。 n在固体培养基上，真菌菌丝可分为：营养在固体培养基上，真菌菌丝可分为：营养菌丝、气生菌丝和繁殖菌丝。菌丝、气生菌丝和繁殖菌丝。 霉菌菌丝类型霉菌菌丝类型按分化程度分：按分化程度分：依依 形形 态态 分：分：1)营养菌丝营养菌丝(vegetatile

46、 hypha): 在固体培养基上伸入基内的菌在固体培养基上伸入基内的菌丝丝. 行吸收养料之功能行吸收养料之功能.2)气生菌丝气生菌丝(aerial hypha): 向空中生长的菌丝向空中生长的菌丝. 发育到一发育到一定阶段可分化成定阶段可分化成 孕育（繁殖）孕育（繁殖）菌丝（菌丝（reproductive hypha）.霉菌（青霉）的菌丝霉菌菌丝类型霉菌菌丝类型依依 形形 态态 分：分：按分化程度分：按分化程度分：无隔菌丝无隔菌丝：为长管状单细胞，细胞质内含多个为长管状单细胞，细胞质内含多个核。核。其生长表现为菌丝的延长和细胞核的其生长表现为菌丝的延长和细胞核的增多。增多。这是低等真菌所具有的

47、菌丝类型。这是低等真菌所具有的菌丝类型。有隔菌丝有隔菌丝菌丝中有隔膜，被隔膜隔开的一段菌丝中有隔膜，被隔膜隔开的一段菌丝就是一个细胞，菌丝由多个细菌丝就是一个细胞，菌丝由多个细胞组成，每个细胞内有一至多个核。胞组成，每个细胞内有一至多个核。隔膜上有单孔或多孔，细胞质和细隔膜上有单孔或多孔，细胞质和细胞核可自由流通，每个细胞功能相胞核可自由流通，每个细胞功能相同。这是高等真菌所具有的类型。同。这是高等真菌所具有的类型。菌落特征：菌落特征：霉菌的菌落大、疏松、干燥、不透明，多呈绒毛状、絮霉菌的菌落大、疏松、干燥、不透明，多呈绒毛状、絮状或网状等，菌体可沿培养基表面蔓延生长，由于不同的真菌孢子状或网

48、状等，菌体可沿培养基表面蔓延生长，由于不同的真菌孢子含有不同的色素，所以菌落可呈红、黄、绿、青绿、青灰、黑、白、含有不同的色素，所以菌落可呈红、黄、绿、青绿、青灰、黑、白、灰等多种颜色。灰等多种颜色。液体培养时的特征：液体培养时的特征：如果是静止培养，菌丝往往在液体表面生长，液面上形成菌膜。如果是静止培养，菌丝往往在液体表面生长，液面上形成菌膜。如果是震荡培养，菌丝可相互缠绕在一起形成菌丝球，亦可形成絮如果是震荡培养，菌丝可相互缠绕在一起形成菌丝球，亦可形成絮片状，与震荡震荡速度有关。片状，与震荡震荡速度有关。霉菌的培养特征霉菌的培养特征（2）重要的代表霉菌 与人类的关系非常密切。日常生活中衣

49、物、食品的发霉现象、酿酒（根）、制酱（曲）、 做腐孔（毛霉）、生产抗生素等。霉菌是人们在实践活动中认识最早并加以利用的一类微生物。2 酵母菌酵母菌yeast 酵母菌是一类单细胞真菌的俗称，分类学上分属于酵母菌是一类单细胞真菌的俗称，分类学上分属于子囊菌纲和半知菌类。子囊菌纲和半知菌类。特征特征:1. 个体一般以单细胞状态存在；个体一般以单细胞状态存在；2. 多数营出芽生殖，有的裂殖；多数营出芽生殖，有的裂殖；3. 能发酵糖类产能；能发酵糖类产能；4. 细胞壁常含有甘露聚糖；细胞壁常含有甘露聚糖；5. 喜在含糖量较高、酸度较大的水生环境中生长。喜在含糖量较高、酸度较大的水生环境中生长。分布：分布

50、：偏酸性的含糖环境。水果、蔬菜、蜜饯的表面，果园偏酸性的含糖环境。水果、蔬菜、蜜饯的表面，果园 土壤中与环境有关。土壤中与环境有关。酵酵 母菌与人类的关系极其密切。母菌与人类的关系极其密切。（1 1）酵母菌的形态和大小）酵母菌的形态和大小细胞直径比细菌粗细胞直径比细菌粗10倍左右，倍左右，15m530m。因此在因此在光学显微镜下可以模糊地看到它们细胞内的各种结构光学显微镜下可以模糊地看到它们细胞内的各种结构分化。酵母菌细胞的形态通常有球状、卵圆状、椭圆分化。酵母菌细胞的形态通常有球状、卵圆状、椭圆状、柱状、香肠状及假丝状等多种。状、柱状、香肠状及假丝状等多种。酵母菌用途 主要用途有：主要用途有： 食品中：有益：酿酒、发面制馒头和面包食