关于优化原核表达的一些总结

1、我认为，进行原核表达条件优化主要应注意以下几方面：1密码子最优化（codon of optimization）：大肠杆菌某些核糖体蛋白质中的使用频率不同，有最佳密码子（optimal codons）或偏爱密码子（preferred codons），稀有或利用率低的密码子（rare or low-usage codons）。大肠杆菌稀有密码子主要有ata，cta，ccc，acg，cga，cgg，agg，gga，ggg等。另外，大肠杆菌偏爱的终止密码子为uaa，而哺乳动物偏爱的终止密码子为uga。同时，终止密码子的下游碱基对翻译有效终止有影响，大肠杆菌中uaan，n的影响力次序为：u>g&g

2、t;a，c；哺乳动物中uagn，n的影响力次序为：a，g>>c，u。我用的pet-43.1，先用宿主菌bl21（de3），没有目的带出现，后改用rosettabluetm（de3），目的蛋白表达效率达50%以上，并且是可溶的。2启动子是dna链上rna聚合酶的识别位点和结合位点，外源基因表达的理想启动子是可以指导高效转录，保证目的基因高效表达的启动子。乳糖启动子是最常用的启动子，但容易引起外源基因的渗漏表达，对细胞的生长产生毒害作用；其他从乳糖启动子构建而来的启动子，多用iptg诱导，iptg对菌体也有毒害作用。若iptg对宿主菌有毒，可以同时加入iptg和乳糖诱导表达，这样可减少

3、iptg的浓度。若目的蛋白有毒，可用invitrogen公司的plex系统等。3培养基的成分：用m9zb和nzcym培养基培养细菌，增加细菌质粒拷贝数；用lb培养基表达外源蛋白，提高蛋白表达量。【毒性较大蛋白表达条件优化】：）一般发酵时高温、高浓度诱导剂（）有利于表达表达包涵体形成，减少毒性。）加大氨苄的浓度（可达400m）并提高培养基中葡萄糖浓度（可达0.5）有利于稳定表达，并要及时补充葡萄糖使其浓度维持在0.5。3）如您遇到对e.coli宿主毒性较大的基因如在普通lb平板上很难生长时，可采用这一配方。具体操作如下：（1）称3.4g nzamine(with mgso4+nacl)加4g琼脂

4、（建议您使用上海生工货号为f0010-50g agar）加蒸馏水至176ml，15磅灭菌25分钟。即为基因表达培养基成份a。（2）将2g nh4cl（无水计）、6g kh2po4（无水计）和 6g na2hpo4 （无水计）加蒸馏水至200ml，15磅灭菌25分钟。即为基因表达培养基成份b母液。 （3）配20%葡萄糖20ml，8磅灭菌25分钟。（4）待上述三种试剂冷却下来，取20ml基因表达培养基成份b母液和4ml 20%葡萄糖，添加至176ml的含2% 琼脂的基因表达培养基成份a中，总计200ml，加氨苄至100120mg/ml浓度，倒固体培养基约10个平板。（5）上述平板放在室温下放置24

5、小时，以使表面变干。（6）将上述克隆鉴定正确的带目的基因的表达质粒0.51mg转化受体菌感受态。【mrna结构可以使用, rna structure ,】http:/www.bio-简单方便.密码子的偏爱性,可在翻译以后,人工完成.预测rna二级结构如下进行：1. 选择file|rna fold single strand启动模块，单击sequence按键，打开对话框以载入序列，此序列必需以.seq为扩展文件名，其它序列文件可在序列编辑器中转为此格式。注意必需为大写字母。2. 输入文件名后，缺省值将填充在剩下的区域，这些值可改变。选取 generate save file选项，在执行算法后生成

6、存盘文件，此存盘文件用于重新折叠与生成点阵图。3. 在此碱基可被强制为单链或双链或螺旋。4. 单击开始键，开始预测运算。5. 需要的话，选择draw structure，在绘图模块中看预测的二级结构结果。输出的二级结构以最小自由能顺序排列。但由于方法的限制与热力学参数的简化，第一个结构并不一定为实际的rna结构，要折叠一个已存贮为.seq文件的序列，可选择菜单选项file|fold rna single strand，直接进入折叠窗口。或单击工具条中的fold rna single strand键。【原核表达条件优化】影响e.coli 中蛋白表达量的因素除载体启动子结构以外，还有质粒拷贝数、质

7、粒稳定性、mrna结构、密码子的偏爱性和宿主菌的生长状态等因素58。由于软件模拟表达，可知mrna结构和密码子的偏爱性两个影响因素不会造成表达困难，所以本实验的工作主要针对载体拷贝数、载体稳定和宿主菌的生长状态。本实验中重组表达质粒prp-pet-32a（+）不稳定的原因可能是prp对e.coli bl21（de3）具有细胞毒性。pet-32a（+）来源于pbr-322，pbr-322源于cole1。cole1、pbr-322 、pet-32a（+）都失去了分配功能区par。而天然质粒具有功能区par，可以保证质粒在每次细胞周期中准确的进行分离，并均等的分配到子代细胞中去。功能区par对质粒p

8、rp-pet-32a（+）的稳定性是不可缺少的4。缺少功能区par的pet-32a（+）质粒在每次细胞周期中随机分配到子代细胞中去，无细胞毒性时约98% e.coli bl21（de3）会带有质粒（见pet system manual34页）。表达有细胞毒性蛋白的e.coli bl21（de3）不具有生长优势，而且随细菌培养时间的增加-内酰氨酶将逐渐释放到溶液中去，破坏溶液中的amp。【-内酰氨酶功能强大，细菌培养稀释1000倍以后还能破坏几乎所有的amp（见pet system manual33页）】。这样本不具有生长优势的表达菌又失去了选择压力，造成大部分新生细菌无质粒，表现为表达困难。本

9、实验证实约60%以上的细菌无质粒。鉴于以上原因，本实验将融合蛋白trx-prpc27-30表达分成两个阶段，前一个阶段为质粒生长阶段，主要保证质粒的稳定性和提高质粒的拷贝数；后一个阶段为融合蛋白表达阶段，待细菌生长达饱和以后，诱导融合蛋白trx-prpc27-30的表达。在温度、amp浓度、培养基等诸多影响质粒prp-pet-32a（+）稳定性的因素中，以温度影响最为明显。实验结果显示，37条件下约60%以上的细菌无质粒prp-pet-32a（+），25条件下失去质粒prp-pet-32a（+）的细菌在约10%以内。其他条件不变，amp浓度在100 ug/ml以上细菌质粒prp-pet-32a

10、（+）基本稳定。随amp浓度增加平板上的菌落逐渐变小，表明amp可抑制细菌生长。不同培养基对prp-pet-32a（+）的稳定性无明显影响，但tb培养基可提高蛋白表达量。实验发现tb培养基比lb提高蛋白表达量约在5-10%之间。本实验中prp-pet-32a（+）稳定性高则融合蛋白trx-prpc27-30表达量高。温度因素是影响本实验融合蛋白表达量最为明显的因素。如图2-9，37条件下，其他条件不管如何改变，都未见融合蛋白trx-prpc27-30有明显表达。带cole1复制起点的质粒，在加入氯霉素以后可以抑制细菌蛋白的生长，但不抑制质粒拷贝数的增加。虽然没有文献可以解释这一现象，我们仍可以

11、推测导致质粒拷贝数增加的蛋白合成系统是独立于细菌蛋白合成系统的，这个系统以一种相对稳定速度合成质粒。所以降低细菌生长速度可增加细菌质粒拷贝数（并间接增加质粒稳定性）从而增加融合蛋白trx-prpc27-30的表达量。本实验在37条件下，诱导前od600为0.6时开始诱导，4 h诱导培养 ，菌液的od600值可达5，未见融合蛋白trx-prpc27-30的明显表达；25条件下，诱导前od600为1.5，更换等体积新鲜tb诱导4h，菌液的od600值可达2.3，融合蛋白trx-prpc27-30的最高表达量接近50%。变化如此之大，出乎意料。amp浓度是继温度条件以后，影响融合蛋白表达量的另一个重

12、要因素。当其他条件不变，amp浓度在50 ug/ml以下时，融合蛋白trx-prpc27-30的表达量在20%以下；amp浓度在200-500 ug/ml条件下，trx-prpc27-30呈高表达，表达量接近50%。但amp浓度加到500 ug/mlamp时则会使细菌的生长速度下降。说明一定的选择压力可以提高质粒的稳定性从而提高融合蛋白表达量，200 ug/ml的amp浓度为最适表达浓度。不同iptg浓度对融合蛋白trx-prpc27-30的表达量无明显影响，0.1 mm的iptg即可达到38%的表达量，1 mm iptg可达最高表达量；乳糖诱导条件下融合蛋白trx-prpc27-30的表达量

13、随乳糖浓度增加而逐渐增加，但乳糖诱导融合蛋白trx-prpc27-30的最高表达量（39.6%）比iptg诱导的最高表达量（45.7%）低。可能是由于乳糖提高了细菌的生长速度，间接降低了质粒的拷贝数，导致表达量下降。乳糖浓度太低时，细菌在诱导表达早期已将乳糖消耗干净，造成诱导不足；乳糖浓度太高，细菌的生长速度过快，降低了质粒的拷贝数，融合蛋白trx-prpc27-30的表达量又有所下降。所以乳糖诱导表现为融合蛋白trx-prpc27-30的表达量，随乳糖浓度增加由低到高，然后又略有下降。当其他条件不变时，用3%乳糖诱导融合蛋白trx-prpc27-30可达最高表达量，而8%乳糖诱导表达量有所下

14、降。随诱导时间的增加融合蛋白trx-prpc27-30的表达量均匀增加，3 h以后接近最高表达量，过夜诱导最高表达量可达47%，甚至接近50%。诱导过程中细菌od600变化不大，由1.5上升为2.0-2.5。与此不同的是，37诱导条件下，无融合蛋白trx-prpc27-30表达时，细菌od600值变化很大，诱导4 h，细菌od600值由0.6上升为5，表明细菌分裂并不是表达融合蛋白所需，甚至可导致蛋白表达量下降。细菌生长接近饱和以后，更换等体积新鲜培养基诱导，可获得高的蛋白表达量。2-2，表2-5）。【通过分子结构预测生物学信息】有人说“生物大分子结构预测是生物信息学中的棘手问题，目前尚无行之

15、有效的方法，预计在未来十年内也很难取得关键性突破。”从rna结构，判断该结构是否影响目的序列的表达，个人的一点点经验供参考：1 寻找转录终止结构，连续的5-10个u后面接一个连续4-10个g-c发夹结构，一般认为回导致转录终止。2 自由能分析，g值58以上，loop中间有大约30个连续的pair，可能翻译困难。3 启动子后9-11个bp以后有太多的u，则转录起始困难。4启动子是否被附近序列封闭。一般来讲，分泌蛋白的成熟部分在蛋白的转运过程中发挥着重要的作用。在信号肽和成熟蛋白之间插入小段寡核苷酸，或者在成熟蛋白的n-末端改变几个氨基酸能够影响目的蛋白的分泌和起转运过程。有人在实验中选择了连续六

16、个组氨酸这个结构，由于它不仅能引入正电荷，而且容易通过金属螯和柱回收。组氨酸六联体的正电荷能引起静电性的排斥，这种排斥作用能改变融合蛋白的构象，从而促进蛋白运送到蛋白内膜上。在寡肽链上带有脯氨酸也能影响融合蛋白的构象，脯氨酸缺少氢键供体集团，而且它与相邻的残基氢键存在的空间位阻，因而它被认为是能破坏螺旋的氨基酸。在endoxylanase信号肽和hg-csf之间插入这些序列，该融合蛋白能高效的分泌到周质中。但是目前我们仍不清楚插入寡核苷酸后具体产生那些变化。稀有密码子的影响在表达量上，除连续的q以外，本人以为，可以通过其他优化方法校正蛋白表达量。我作过一个中间带终止子的蛋白，获得了20%的表达

17、量。【一般来说表达量大时易形成包涵体】。1 先试一下延长表达时间（过夜），降低温度（2530）或提高温度（4042），不行再作其他分析。2 进行质粒稳定性试验。3 密码子偏爱性分析和rna结构分行。4 突变纠正密码子偏爱性，修正rna结构。5 以上无结果，进行蛋白毒性，蛋白稳定性分析，更换宿主菌。 【原核表达要考虑的因素】我也在用pgex原核表达载体表达人源基因，融合蛋白约为121kd，表达水平还是可以的。如果表达载体构建、宿主菌转化等环节没问题的话，关键还是表达条件的优化，尽量减少包涵体的形成，增加可溶性蛋白的含量。我觉得有以下几点你可以试试：1、降低表达温度，我试过多个温度梯度，最后还是选

18、用25度。当然温度的优化还要视具体蛋白而定，温度太低可致细菌生长缓慢，蛋白表达也会受影响。2、降低诱导剂的浓度，要进行诱导剂浓度的优化，可围绕0.1mm上下设几个浓度梯度，诱导剂浓度过高则会增加包涵体的形成。3、诱导时间也需优化，诱导时间过长，可溶性蛋白的含量不再会有大的增加，反而可溶性蛋白的分解会增多。毕竟在原核表达系统中表达真核基因，要保持其稳定性是有一定难度的，不可避免有一定量的蛋白会被分解掉。时间过长包涵体也会增多。4、培养基中可以试着加点葡萄糖，通常用2%的浓度。5、在培养过程中，要保持细菌摇瓶有良好的通气条件，充足的氧流量可以减少包涵体的形成。总之，表达条件的优化是很烦琐，各种条件

19、的优化都要根据具体蛋白的特性，通过反复的摸索才能确定。最后感谢prp提出了这么个有价值的post，希望大家以后多多交流！【胞内表达有生物活性蛋白的一些策略】包涵体的形成仍然是胞内基因表达巨大障碍，考虑到易聚合蛋白质复性的艰辛以及收得率的问题,胞内直接表达有生物活性的蛋白质仍然有一定的意义，到现在为止，形成包涵体的理化因素仍然不清楚，统计分析的出的结论是六个因素与包涵体的形成有关：电荷的分布、转型氨基酸残基的含量、半胱氨酸的含量、脯氨酸的含量、亲水性和总氨基酸数量（1）。有多种手段用于减少包涵体的形成以及促进蛋白质的折叠，如低温培养（3、4、11）、宿主菌的选择（12）、某些氨基酸残基的取代（1

20、4）、共表达分子伴侣（17）、硫氧还蛋白的融合表达或与目标蛋白共表达（18）和利用硫氧还蛋白还原酶缺陷菌株作为宿主菌（2、16）等。胞内的氧化还原势是另外的问题，细菌的胞内蛋白质半胱氨酸残基和二硫键较少，含有大量二硫键的蛋白质则被输送到胞浆以外。这样那些依靠二硫键来稳定蛋白质四级结构的蛋白质在细菌的胞浆内因为缺乏形成二硫键的系统如dsba/dsbb难以正确折叠。有人分离到允许胞内二硫键形成的突变株，这些突变株使编码硫氧还蛋白还原酶的trxb基因失活以及造成一定的还原势。硫氧还蛋白本身对于二硫键的形成不是必需的（16），该作者认为胞内有其他的类似于硫氧蛋白的蛋白能被硫氧还蛋白还原酶还原，在硫氧还

21、蛋白还原酶缺陷的情况下，处于氧化状态的这类蛋白质能促进二硫键的形成。这些硫氧还蛋白还原酶缺陷菌被证实为在大肠杆菌中生产复杂蛋白质的很有价值的工具。novagen公司pet宿主菌系列中的ad494（de3）和origami b(de3)都是trxb基因突变菌株。（2）低温培养yumiko shirano等（3）把稻谷的脂肪氧合酶lipoxygenase l-2cdna 的n端融合了18个氨基酸，利用t7 rna聚合酶启动子系统表达，在37条件下诱导表达3小时，结果得到没有活性的lipoxygenase，但是在15条件下诱导16小时，有活性的脂肪氧合酶达到胞内可溶蛋白质的 3%，该文章介绍到，在含

22、有50ug/ml氨苄的lb培养基中将工程菌培养到od600=1.0，用0.4mm 的iptg分别在37和15条件下诱导，得到的菌体用水洗涤然后重悬于50mm 的tris-hcl，10%甘油，0.1%吐温-20 ， 1mm edta和 0.5m nacl溶液中以稳定该酶，然后破菌。5000g离心15分钟，37培养的后用triton x-100 /1 mm edta洗涤包涵体，用硫酸铵沉淀的办法得到上清液中的酶，沉淀溶解于10mm 的ph6.8的含有10%甘油，0.1%吐温-20 ，0.1mm edta 磷酸钠缓冲液中用于测活。结果，在37条件下表达的融合产物占总蛋白的27%但是检测不到酶活性。其

23、包涵体经过triton x-100简单洗涤后纯度较高。15条件下诱导16小时，破菌后的上清中含有较高的酶活。而且酶在上述条件下稳定。类似的溶解性依赖于温度的多种蛋白质见文献（9 ）。25-30则是常用的培养温度，低温有利于有活性表达的另一种解释是低温培养时，细菌生长缓慢溶氧水平较高，不易出现缺氧的情况。太低的温度会使降温的成本升高。合适的ph条件包涵体的形成也有有利的一面，如简单的破菌和洗涤即可得到纯度较高的蛋白，聚合形式的蛋白质有利于防止蛋白酶的水解。易于复性的蛋白质则设法使之形成包涵体，因此也有人研究有利于包涵体形成的条件。seiji sugimoto等（5）报道了较高ph有利于重组鲑鱼生

24、长激素（sgh）的包涵体的形成。他们利用色氨酸启动子，用了两套培养基，lgtrpap(1%蛋白胨0.5%酵母膏、0.5%氯化钠、0.5%葡萄糖、0.5%色氨酸以及50ug/ml的氨苄)和mcgap（m9培养基补加0.5%casamino acid及50ug/ml的氨苄。结果表明在ph6.6的情况下包涵体比例为45%而ph7.6时为85%，在低ph条件下因为可溶的sgh抑制了宿主的生长，确定了高ph有利于包涵体形成之后，他们又做了温度对细胞自溶的实验，试验30-37培养温度对生长曲线的影响，发现在30、33条件下到稳定期以后od不下降，而在37时od下降。得出的结论是在33时表达最佳，100%的

25、包涵体形式存在而且菌体密度也最大。该蛋白质的等电点为6.0，而大肠杆菌的胞内生理ph6.8-7.2，形成包涵体的原因不大可能是因为ph在等电点的原因。较高的ph可能是影响了蛋白质的折叠过程或促进折叠过程的中间体的聚合从而形成了包涵体。就sgh来说较高的ph（7.6）有利于形成包涵体，各种蛋白质的情况不一样，也有可能其他的蛋白质在较高的ph条件下有利于形成溶解状态的有活性形式的蛋白质。这需要实验来确定。但是这个ph范围非常有限例如ph到8.0大肠杆菌的生长就会受到影响。在有甜菜碱的条件下高渗透压有利于形成可溶的有活性的蛋白质john r. blackwell（ ）等报道了在山梨醇和甘氨酰甜菜碱（

26、glycyl betaine）存在情况下培养和诱导工程菌得到了大量的有活性和可溶状态的dmapp/amp转移酶，而用常规的方法诱导得到的是没有活性、不溶的包涵体复合物。该文章说道；不溶的包涵体是目标蛋白质和核糖体、核酸以及其他胞内蛋白质的复合物，该方法涉及利用渗透压使得细胞吸收一些相容的溶质如glycyl betaine，虽然是在表达dmapp/amp转移酶时得到的实验结果，但是很可能对其他重组蛋白的生产也有用处。他们用的甜菜碱的浓度为2.5mm,而山梨醇的浓度试验了330、660、1000mm不等的浓度培养基两种lb和m9盐培养基补加1%0.5%casamino acid、2%的蔗糖和5mg

27、/ml 硫胺素1mmcacl2、1mmmgso4。 37条件下培养至od600=0.5-0.6冷至25用于诱导，诱导剂为萘啶酮酸200ug/ml，分别在25、37条件下诱导3小时。结果在缺乏山梨醇和甜菜碱的组中。>90%的细胞形成了在光学显微镜下能够观察到的包涵体而家了山梨醇和甜菜碱的组中<1%的细胞有包涵体，在初始实验中用的是m9培养基在25条件下山梨醇加量为1m是酶活提高了30-180倍，主要是对照的酶活几乎检测不到，导致倍数比较大，在后来的实验中使用了营养丰富的lb培养基，得到了有更高活性的酶，从表上的结果看到低温和补加山梨醇及甜菜碱的酶活最高。通过控制实生长条件得到活性蛋白

28、是常用的手段，多种蛋白质在25-30诱导时能够得到有活性的蛋白，而在生长最适温度37则不行,这意味着胞内的环境改变了使得适合于有活性的蛋白质构象或增加蛋白质的稳定性。这种变化有可能是因为类似于甜菜碱的物质浓度变得高了，这类物质被认为被排除在蛋白质之外从而稳定蛋白质，最小程度的溶剂-蛋白质的接触稳定蛋白质。（）众所周知，如果培养基中含有甜菜碱大肠杆菌能在很高的氯化钠浓度（如800mm ）的培养基中生长,细胞吸收甜菜碱以平衡渗透压。本实验就能说明这个问题。更有趣的是lb培养基和m9 cas培养基之间有很大的差异。可能是因为lb培养基相对来讲环境的渗透压更高因为他含有170mm的氯化钠和较高浓度的氨

29、基酸和各种各样的酵母膏溶质。降低氯化钠浓度使得酶活减少支持这种解释。这种做法有很好的实际应用价值，因为通过此法可以足量的有活性的酶用于纯化。掌握这些培养条件后可以做各种定点突变的研究不同诱导方案每od600、ml抽提液的酶活比较培养基 诱导温度 山梨醇浓度 酶活 相对活性m9 cas 37 0mm 1.2 1 25 1000mm 51.2 4462lb 37 0mm 31.2 26 37 660mm 74.4 62 25 * 0mm 31.3 26 25 0mm 80 66 25 330mm 208 173 25 660mm 378 315 25 1000mm 512 427*添加10%的氯化

30、钠关于甜菜碱类物质有助于稳定蛋白质有很多的报道。在蛋白质复性中很流行的添加剂：非去污的甜菜碱磺酸系列：non detergent sulfobetaine(nds 如ndsb201、ndsb256、ndsb195等它们是两性分子，添加这类物质可以有效地防止蛋白质分子的聚合从而促进复性效率。goldberg me等报道了五种ndsb能是蛋清溶菌酶复性效率提高12倍，其中几种能使beta-d-galactosidase 复性效率提高80倍之多。（） 复性中添加糖类物质防止蛋白质分之的聚合、稳定蛋白质构象是常用的手段，关于在培养基中添加糖类防止包涵体的形成也有报道（），但是这种做法适用于分泌型蛋白质

31、，如果在培养基这不补加蔗糖或绵子糖，分泌到周质内酰胺酶会形成包涵体，酶活很低，而补加0.3m蔗糖或绵子糖，可溶的目标蛋白提高了4倍。诱导后菌体会形成大量的分泌型目标蛋白到周质中，过量表达的结果是外膜缺损导致可溶性的周质蛋白漏到细胞外。不像内膜，革兰氏阴性菌的外膜允许分子量小于600的亲水性溶质进出但是它们不能通过内膜从而不能被代谢，因此不会影响宿主的生长。蔗糖等非代谢糖进入周质起到防止蛋白质聚合的作用。受到细胞膜通透性的影响，许多利于防止蛋白质聚合的添加剂改善培养环境不一定能利于蛋白质的折叠，但是复性中常用的控制蛋白质浓度防止聚合的原理可能利于获得活性蛋白，有时复性的蛋白质浓度要控制在20ug

32、/ml以下才能防止蛋白质的聚合（15）。色氨酸酶工程菌（本人的硕士论文）表达中发现0.2mm的iptg诱导的酶活比1mm明显高出许多。低温培养明显比最适培养温度的活性高。较低的iptg浓度可能使得局部的蛋白质浓度不会太高，由于原核生物的转录与翻译是同时进行的，缓慢转录使得翻译的蛋白质有机会和条件正确折叠。参考文献：1、microbioologycal review sept 1996 p512-538 straegies for achieving high-level expression of genes in escherichia coli 2、pet system manual3、f

33、ebs letters 295 10-12 a novel strategy for production of a highly expressed recombinant protein in an active form 4、febs letters 271 128-130 (1990) low tem. cultivation of e.coli carryinga rice lipoxygenase l-2cdna produce a soluble and active enzyme at a high level5、biotechnol lett 13:385-388 highe

34、r culture ph is preferable for inclusion body formation recombinant salmon groth hormon in escherichia coli6、fold des 1996;1(1):21-7 non-detergent sulphobetaines: a new class of molecules that facilitate in vitro protein renaturation7、biotechnology progress (vol.4 no.2) the effect of sugar on b-lact

35、amase aggregation in escherichia coli8、eur j biochem 1998 aug 15;256(1):128-35 interactions of non-detergent sulfobetaines with early folding intermediates facilitate in vitro protein renaturation9、 bio/technology 7 1141-1149 production of soluble recombinant protein in bacteria10、 preparation of ac

36、tive protein from inclusion bodies. from internet 11、gene 85 553-557 growth at sub-optimal temperature allows the production of functional ,antigen-binding fab fragment in escherichia col12、 dev. ind. microbial 28:45-52 solubility of protein overexpressed in escherichia col13、protein eng. 7:933-939

37、improving protein solubility through rational ly designed amino acid replacement 14、bio/technology 10:435-440 cysteine to serine substitutions in basic fibroblast growth factor effect on inclusion body formation and proteolytic susceptibility during in vitro refolding .15、eur j biochem 1996 mar 1;23

38、6(2):558-62folding and activation of human procathepsin s from inclusion bodies produced in escherichia coli16、science 262:1744-1747 mutation that allow disulfide bond formation in the cytoplasm of escherichia coli17、febs letters 322 6-9 chaperonins dependent increase of cu、zn superoxide dismutase p

39、roduction in escherichia coli 18、bio/technology 11 187-193 a thioredoxingene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the e. coli cytoplasm19、gene 159:203-207 functional antibody single chain fragments from the cytoplasm of e. coli :influence of thioredoxin reductase(trx

40、20、 arakara . t (1985) biophys. j.47.411-414【关于分泌型蛋白】分泌表达:在ecoli中用pelb信号肽引导分泌，发现表达量比单独表达高很多?能否详细说明一下。所谓的单独表达是否为胞内非融合表达即atg直接和目的基因连接？细胞质膜蛋白，周质蛋白和外膜蛋白以带有n-端信号肽的前体形式在细胞质中合成，随后穿膜运送到周质或定位到内外膜上。在穿膜的过程中，信号肽被信号肽酶切除，将外源蛋白的基因置于原核蛋白信号肽序列的下游有可能实现分泌表达。许多信号肽序列被应用于大肠杆菌表达系统并成功地使目的蛋白转运到周质空间中，如大肠杆菌的phoa ,ompa,ompt,om

41、pf,lamb,pelb,cex信号肽 ,金黄色葡萄球蛋白a信号肽，枯草杆菌内葡聚糖酶信号肽和人生长激素信号肽等。但是并不是任何蛋白加上信号肽序列都可以转运到周质中的。一些结构相似的蛋白有的可以顺利地转运到周质空间中；有的在同样的条件下却不能。人们认为这样的现象可能是由于这样一些原因，如变弱的外膜的自溶作用，目的蛋白的产量低和蛋白质的不完全加工，以及大肠杆菌中待分泌蛋白的特性差异。具体的原因有待进一步的研究。1. ki jun jeong and sang yup lee. protein expression and purification 23. 311-318(2001)7. pasc

42、al belin and paul louis boquet. microbiology (1994)140,3337-3348影响实现分泌表达电荷的分布、转型氨基酸残基的含量、半胱氨酸的含量、脯氨酸的含量、亲水性和总氨基酸数量等等。有多种手段用于减少包涵体的形成以及促进蛋白质的折叠，如低温培养、宿主菌的选择、某些氨基酸残基的取代、共表达分子伴侣、硫氧还蛋白的融合表达或与目标蛋白共表达和利用硫氧还蛋白还原酶缺陷菌株作为宿主菌等。例如，除了选择合适的信号肽和融合子外，培养的条件的选择也是很重要的。因为它影响着目的蛋白的分泌速度和表达水平。一般来讲，培养温度影响着分泌的速度，分泌速度又与蛋白质的正

43、确的折叠有关；启动子和诱导剂的浓度影响着表达的水平。而且在研究中发现，利用不同的菌种，分泌的效果也是不同的。目前普遍接受的观点是在低温下培养细胞.j.winter等人在人proinsulin的分泌表达中将dsba和目的蛋白融合表达。他们在实验中发现几个参数影响着融合蛋白的分泌，如宿主菌和培养条件 ，特别是它的培养基的组成。加入l-精氨酸或者乙醇到培养基中能够提高三倍融合蛋白的产量。他们认为乙醇能够影响周质空间中proinsulin的氧化折叠，而精氨酸能够提高正确折叠的重组蛋白。利用这个培养条件最终获得的目的蛋白占总蛋白的1.8%。【原核表达体系的构建】选rosetta(de3)在原核蛋白表达过

44、程中，选择构建一个合适原核表达体系需要综合考虑3大因素：表达载体、宿主菌株、表达诱导条件,以获得最满意的表达效果。事实上，在平时的实验中，最容易被忽视的就是宿主菌的选择多数人会直接选择自己实验室曾经用过的表达菌株，或者是载体配套的菌株，而不去追究原因即使表达结果不佳，大多在表达条件和载体上找原因，也不会考究菌株的选择是否适合。 作为原核表达的宿主，对外源基因的表达会产生一定的影响，是勿庸置疑的。每一个宿主细胞都像一个微观的小工厂，按照细胞固有的程序完成“你给它们安排的生产任务”因为很难亲眼观察微观世界中表达是如何进行的，当出现问题时，我们需要经验判断问题所在。宿主细胞对原核表达可能会产生哪些影

45、响呢？ 知其然还要知其所以然。比如，菌株内源的蛋白酶过多，可能会造成外源表达产物的不稳定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成为理想的起始表达菌株。堪称经典的bl21系列就是lon和ompt蛋白酶缺陷型，也是我们非常熟悉的表达菌株。大名鼎鼎的bl21(de3)融源菌则是添加t7聚合酶基因，为t7表达系统而设计。 真核细胞偏爱的密码子和原核系统有不同，因此，在用原核系统表达真核基因的时候，真核基因中的一些密码子对于原核细胞来说可能是稀有密码子，从而导致表达效率和表达水平很低。改造基因是比较麻烦的做法，rosetta 2系列就是更好的选择这种携带prare2质粒的bl21衍生菌，补充大肠杆菌缺乏的七种（

46、aua, agg, aga, cua, ccc, gga 及cgg）稀有密码子对应的 trna，提高外源基因、尤其是真核基因在原核系统中的表达水平。（已经携带有氯霉素抗性质粒） 当要表达的蛋白质需要形成二硫键以形成正确的折叠时，可以选择k12衍生菌origami 2系列，thioredoxin reductase (trx 和glutathione reductase (gor)两条主要还原途径双突变菌株，显著提高细胞质中二硫键形成几率，促进蛋白可溶性及活性表达。（卡那霉素敏感） rosetta-gami 2则是综合上述两类菌株的优点，既补充7种稀有密码子，又能够促进二硫键的形成，帮助表达需要

47、借助二硫键形成正确折叠构象的真核蛋白。（卡那霉素敏感） origami b是衍生自 laczy突变的 bl21菌株，这个突变能根据iptg的浓度精确调节表达产物，使得表达产物量呈现iptg浓度依赖性。（四环素敏感） 在决定试用这些名字古怪的菌株时，有几个小tips要注意的，一个是不同菌株有时已经携带某个质粒或者已经具有某种抗生素抗性，要注意自己的表达质粒是否能与之兼容。比如rosetta 2 已经携带有氯霉素抗性质粒，不能再用氯霉素筛选等等。现象可能原因改进方案建议菌株无蛋白表达e. coli 的密码子偏移性补充稀有密码子的trna；将稀有密码子突变为普通大肠杆菌密码子rosetta 2ros

48、etta-gami 2rosetta-gami brosettablue出现截短蛋白包涵体二硫键形成困难降低宿主胞质的还原性；利用促进二硫键形成的各种载体标签origami 2rosetta-gami 2rosetta-gami b表达过快，表达量过高控制优化表达水平：降温，iptg浓度优化tunerrosetta-gami b蛋白无活性蛋白错误折叠降低宿主胞质的还原性；利用促进二硫键形成的各种载体标签origami 2rosetta-gami 2rosetta-gami b控制优化表达水平：降温，iptg浓度优化tunerrosetta-gami b细胞死亡，生长极困难毒性蛋白更严格的本底表

49、达控制plyss 菌株无克隆生长过高本底表达更严格的本底表达控制plyss、plyse 菌株重组质粒和菌株的保存建议在实验室里保存重组菌株的时候，为了挑菌和传代方便，我们常用lb平板保存在4冰箱中，需要提质粒和表达接种的时候，就直接从平板上挑菌，但是这种方法对于重组质粒的稳定性不利，容易出现质粒丢失、表达水平不稳定、菌株退化乃至发生污染等情况。 我们建议：1、 长期存放菌株和pet重组子应该存在甘油70保种。但是要注意高浓度甘油(> 10%)会导致质粒不稳定。请尽量保持甘油浓度8。（15%浓度的甘油保种液和新鲜菌液1:1就行）2、重组质粒不宜长期保存于表达菌株（带de3的大肠杆菌）中，请

50、尽量使用带有reca enda突变的克隆菌株（比如c600，dh5a）进行质粒抽提和保存质粒。表达型的菌株提质粒经常会有质量不高或者背景的问题。特别是大量抽提。(生物通改编) 其实不仅仅是表达，建库克隆都会涉及菌株的不同要求，推荐看看以下文章：克隆/建库专用超级高效感受态细胞 。感受态不是目的，菌株的背景才是关键。【novagen公司的pet系列载体】之所以首先介绍novagen公司的产品是因为用过它的pet系列载体，感觉很好用。novagen的母公司是德国默克（merck）公司，它是 国际著名的化学及制药公司总部位于德国的darmstadt，已有300多年 的历史。已在全世界55个主要国家设

51、立了分公司，其中在28个国家建 有62个生产基地。novagen公司出品的pet系列载体是目前应用最为广泛的原核表达 系统，已经成功地在大肠杆菌中表达了各种各样的异源蛋白。pet系列 载体是利用大肠杆菌t7噬菌体转录系统进行表达的载体，其表达原理 见下图。t7噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一体系中的 元件为基础构建的表达系统称为t7表达系统。t7噬菌体基因编码的t7rna聚合酶选择性的激活t7噬菌体启动子的转录。它是一种高活性的rna聚合酶，其合成mrna的速度比大肠杆菌rna聚合酶快5倍左右。并可以转录某些不能被大肠杆菌rna聚合酶有效转录的序列。在细胞中存在t7 rna聚合酶

52、和t7噬菌体启动子的情形下，大肠杆菌宿主本身基因的 转录竞争不过t7噬菌体转录体系，最终受t7噬菌体启动子控制的基因 的转录能达到很高的水平。t7噬菌体启动子的转录完全依赖于t7 rna聚合酶，因此t7 rna聚 合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调控方式。噬菌体de3是噬 菌体的衍生株，一段含有lac，lacuv5启动子和t7 rna聚合酶基因的 dna片段倍插入其int基因中，用噬菌体de3的溶源菌，如bl21(de3)、 hms174(de3)等作为表达载体的宿主菌，调控方式为化学信号诱导型， 类似于lac表达系统。从开始涉及表达的时候可以根据是否要用基因本身的起始密码子 进行选择，n

53、ovagen公司仅提供三个载体：pet-21(+)，pet-24(+)和pet-23(+)。如果你打算利用载体的起始密码子，那么就有许多选择。根据是否要可溶性表达，选择加有不同标记的载体。一般说来在 大肠杆菌中不加标记外源蛋白都会以不溶的包涵体形式表达。为了让 外源蛋白融合表达一般说来有三个策略：1. 与一个高度可溶的多肽联合一起表达，比如：谷胱甘肽s转移酶（glutathione s transferase, gst）、硫氧还蛋白（thioredoxin, trx）和n利用质a（n utilization substancea, nusa）。2. 转入一个酶催化二硫键的形成，如：硫氧还蛋白，

54、dsba，dsbc。3. 插入一个定位到周质空间的信号序列。不同载体提供不同的标记，有的可以同时带有多个标记。如果你 不希望在蛋白的n末端加入任何的多肽，你也可以选择用nde直接从 起始密码子后插入外源片断，或者在得到表达产物后利用蛋白氨基酸 的酶切位点把多余的多肽切除。在重组技术上，novagen除了传统的酶切、连 接方式外，还有不需要连接的克隆方式：ligation-independent cloning，简称lic。采用lic方法的pet载体是线性化的，在末端有12-15个突出的碱基以在退火时和目的片断互补。在设计pcr扩增引物时 加入与lic载体互补的序列，pcr产物用35的内切酶消化

55、出单链与载体互补的序列。通过这种方式就可以把目的片断定向、高效地插入lic载体上。一般的pet载体是先在不含de3片段的菌株中进行克隆筛选，之后再 把阳性克隆转化进入表达菌株，如bl21（de3）中，通过iptg诱导进 行表达。而petcoco载体它引入了低拷贝控制元件，f附加体上的oris和 repe元件与parabc共同作用下使质粒在细菌中保持单拷贝，这样即可 以使质粒在细菌内稳定存在又可以减少外源蛋白对细胞的毒害作用。 当我们需要大量表达时加入树胶醛醣诱导trfa基因表达，质粒在细胞内 的拷贝数就可以增加到25-50。petcoco载体同时兼容了de3调控模型， 在加入iptg后诱导表达

56、量达升高2500倍。在保证质粒稳定性这一点上除了petcoco的方法还有另一种方法就是 将重组质粒转化进入含有t7 rna聚合酶抑制剂的t7溶菌酶表达基因的 菌株中，在含有plyss的plyse宿主菌内重组质粒的本底表达被进一步 抑制，质粒可以更稳定地存在。novagen提供多种表达使用的菌株，为了提高表达量做出了各种改 造，它们大致分为以下几个种类：1. 蛋白酶缺陷型 所有b菌株的衍生株都是lon蛋白酶和ompt蛋白酶缺陷型的，这包 括有b834, bl21, blr, origami b, rosetta和tuner。因此在 纯化时可以保持蛋白的稳定不被降解。bl21(de3)是应用最多的

57、 表达的表达菌株。另外它的衍生株blr(de3)是reca，reca是大 肠杆菌中介导同源重组的重要蛋白之一。它的缺失，可以保证质 粒的稳定。2. 保证所有细胞以同样量进行表达tuner株及它的衍生株（origami b和rosetta）是bl21菌株 的lacy1缺失突变型，在这些菌株中可以使蛋白以同样水平在所有 细胞中表达。lac渗透酶的突变使进入每个细胞的iptg量都是一 致的，这样使蛋白表达浓度可以随着iptg浓度而改变。通过对 iptg浓度的控制可以使细胞微量表达或者大量表达。一般说来， 低浓度表达有利于蛋白的可溶性和活性。3.二硫键形成与溶解性增强 二硫键的形成对某些蛋白的可溶性起

58、到重要的作用，而novagen也 专门设计了一些菌株是谷胱甘肽还原酶（gor）和/或硫氧还蛋白还 原酶（trxb）缺陷型的，包括ad494，bl21trxb， origami，origami b和rosetta-gami。在这些菌株中表达蛋白，可以更大程 度促进二硫键的形成，并使蛋白以可溶形式和有活性形式出现的 可能增加。4. 稀有密码子的补给 不同物种有不同的密码子偏爱性，如果外源蛋白中含大量大肠杆 菌的稀有密码子，特别当这些稀有密码子呈连续分布的时候，就 会造成蛋白表达量极低，或者翻译提前终止。rosetta是为了表 达真核蛋白而特别设计的，它含有大肠杆菌稀有的密码子trna， 包括aua，agg，aga，cua，ccc和gga。它们以氯霉素抗 性的质粒形式存在。rosetta系列是来自bl21lacy1，所以它具有 bl21lacy1的所有