His-GFP蛋白的纯化步骤

1、以 His-GFP 为例简述 His-tag 蛋白的纯化His-tag 是重组蛋白中最常用的融合标签之一。 使用镍柱纯化 His-tag 融合蛋白的原理为： 组氨酸的咪唑侧链可亲和结合镍、 锌和钴等金属离子， 在中性和弱碱性条件下带组氨酸标签 的目的蛋白与镍柱结合， 在低pH下用咪唑竞争洗脱。实验中一般选用6个组氨酸（His6-tag） 的标签。 His6 标签有许多优点：（1）由于只有 6 个氨基酸， 分子量很小， 对蛋白结构和活性的影响较小，一般不需要酶切去除；（2）可以在变性条件下纯化蛋白，在高浓度的尿素和胍中仍能保持结合力；（3）His6 标签无免疫原性，重组蛋白可直接用来注射动物，也

2、不影响免疫学分析。His6 标签也有一些不足，如目的蛋白易形成包涵体、难以溶解、稳定性差及错误折叠 等。镍柱纯化时金属镍离子容易脱落， 混入蛋白溶液， 不但会通过氧化破坏目的蛋白的氨基 酸侧链，而且柱子也会非特异吸附蛋白质，影响纯化效果。本实验将以 H is-GFP （绿色荧光蛋白）为例，阐述 His-tag 蛋白的纯化过程。1. E. coli 重组菌体破碎表达完成的 E. coli 重组菌体，经超声或细胞破碎仪进行破碎。当需要破碎的细胞沉淀 较少（v 1 g）时，通常在Eppendof管中，用超声法完成细胞裂解。而当细胞沉淀较多时， 可选用细胞破碎仪进行破碎。本实验采用细胞破碎仪法。细胞破

3、碎仪法：称量细胞沉淀的湿重，加入细胞湿重10倍体积的裂解缓冲液。女如, 1 g细胞沉淀加入约10 ml 的裂解缓冲液， 使得细胞在溶液中的终浓度为 10-15%，在此范围内细胞破碎的效果较 好。过浓或过稀的细胞浓度均不利于破碎效率。裂解缓冲液的组成如下：Lysis buffer ： 20 mM Tris-HCl, pH 7.4100 mM NaCl10 mM imidazole0.1% Triton X-1001 >protease in hibitor将细胞沉淀在裂解 buffer 中充分搅拌至没有结块后，进行高压破碎。细胞破碎仪的使用方法：首先加水至规定线后，开压缩机，将冷却水制冷至

4、4oC,方可使用。本过程可能要要持续 20 min 左右。待水冷却至 4oC 后，开始破碎。为保证破碎效果，一般重复三次。破碎完成后，一定要 卸压、放水、清洗样品槽。2. 离心细胞裂解液 15000 rpm 、 4oC 离心 45 min ，去除细胞碎片。离心完成后，得到的上清即 细胞裂解液上清用来做进一步的纯化。对于 GFP 来说，由于折叠好的 GFP 本身具有颜色， 因此可以通过颜色来判断在细胞裂解液上清、沉淀中是否具有GFP。在本实验中，ml的培养物最终得到了g的细胞沉淀，加入ml的裂解缓冲液，最终得到 ml 的细胞裂解液上清。3. His-GFP 蛋白的纯化Ni sepharose 6

5、 FF 凝胶的预处理： 在直径 2.5 cm 的层析柱中装入适量的凝胶。本实验 中选用2 ml凝胶(CV = 2 ml )。待液体流完后，分别用5 CV H 20和5 CV平衡缓冲液处理凝胶。平衡好的凝胶以待使用。平衡缓冲液的配制：20 mM Tris-HCl, pH 7.4100 mM NaCl10 mM imidazole吸附：将平衡好的凝胶加入到细胞裂解液上清中。 将此混合物在 4oC 层析柜的混匀器上 混匀 30 min 。装柱： 将层析柱的下端打开，让未结合的蛋白随液体流出，收集流穿(flow through )。如果 GFP 完全吸附到柱子上，那么流穿中应该没有颜色，而柱子上应该有

6、较重的黄绿色。 流穿中的黄绿色越重，说明蛋白的吸附不理想。这种情况下，需要考虑调整平衡缓冲液的 pH、NaCl 的浓度、咪唑的浓度；以及吸附时间、细胞裂解液上清：凝胶的体积比等。洗脱非特异吸附的蛋白： 用10 ml的10 mM imidazole (溶解在20 mM Tris-HCI, pH 7.4 ，500 mM NaCl 中)洗脱非特异吸附的蛋白，自然流速洗脱，每 1 ml 一收集。目的蛋白的洗脱： 分别用10 ml的50 mM、250 mM、500 mM的imidazole (溶解在20 mMTris-HCl, pH 7.4，100 mM NaCl中)洗脱目的蛋白，自然流速洗脱，每1 m

7、l 一收集。洗脱级分的检测： 10% SDS-PAGE 检测各洗脱级分。镍柱的清洗： 如果柱子上仍有残留的蛋白或者是脂类等物质未被洗脱下来，可以用 2 MNaCl或0.5 M NaOH在自然流速下洗 2 cv,然后用5 cv H2O继而5 cv平衡缓冲液冲洗。镍柱的再生： 如果镍柱已使用超过 5次，或明显可看到镍柱颜色变浅， 或纯化其它蛋白 担心引起交叉污染,可对镍柱进行再生,程序如下：1) 5 cv binding buffer2) 5 cv EDTA (in 20 mM Tris-HCl ， pH 7.4 ， 500 mM NaCl )3) 5 cv H 2O4) 5 cv binding

8、 buffer5) 2 cv 0.1 M NiSO 46) 5 cv H 2O7) 5 cv binding buffer 此时，柱子再生完毕，可继续使用。蛋白纯化中应注意的事项：1. 缓冲液的选择： 应根据目标蛋白的 pI 值和 pH 稳定性等条件来选择。例如， GFP 的 等电点是 5.67，那么我们估测 GFP 在 pH7.5 附近应该为稳定的， 因此我们首先尝试 pH7.4 的 Tris-HCl 缓冲液。如果实验结果表明该 pH 条件不稳定，那么我们再考虑 换用其它缓冲体系。注意选择缓冲液时应避开蛋白质的等电点，因为蛋白质在其等 电点时溶解度最小，容易沉淀，不利于蛋白质的稳定。此外，在

9、进行融合表达时， 计算目标蛋白的 pI 时，应考虑到融合标签的影响。2. 平衡缓冲液中 NaCI及imidazole浓度的选择：在平衡缓冲液中加入 NaCI及imidazole 均是为了尽可能减少非特异吸附。具体浓度应根据 Ni 柱说明书及具体蛋白的特性 进行调节。3. 吸附时间的选择： 对于镍柱而言，一般 30 min 的吸附时间即已足够。但是对于一 些吸附较差的蛋白，可酌情延长吸附时间。但需要注意的是，吸附时间过长，可能 会增加非特异吸附。因此需要在目的蛋白的吸附和非特异吸附之间做出平衡。4. 细胞裂解液上清： 凝胶的体积比： 可根据 Ni 柱说明书中的每 ml 凝胶的蛋白载量进 行适量调

10、节。凝胶过少，则目标蛋白不能完全吸附，从流穿中流出；凝胶过多，则 导致洗脱体积变大，以及不必要的非特异吸附。5. 目标蛋白的洗脱： 用高浓度的 imidazole 进行目标蛋白的洗脱时，如果对该蛋白没 有纯化经验，可采用线性imidazole梯度进行洗脱， 如从10 mM -500 mM imidazole 进行洗脱，找出目标蛋白被洗脱出来的 imidazole 浓度区间。如采用分步梯度洗脱， 应保证每个梯度均应洗 2 倍柱体积以上。6. 洗脱蛋白的检测： 用 SDS-PAGE 检测目的蛋白的纯化情况。 具体使用多大浓度的分 离胶，应根据目标蛋白的分子量确定； 上样量的多少， 可粗略根据洗脱级分的 280nm 的吸光度进行估测，一般来说，