EMSA试验成功的关键讲义(doc7页)(正式版)

1、EMSA 试验成功的关键因素 :1.1 .试验设计 ,主要是你用药品刺激细胞时,设计的药品浓度和时间剃度的问题 , 这个很关键 , 很多同学不注意这一点 , 最后试验确实是拿不到阳性结果比如我一前一个朋友用药物处理SGC7901 细胞 ,就是因为时间点设计的不好 EMSA 试验结果是阴性的 ,后来根据自己药品刺激的特性重新设计了刺激时间剃度, 最终得到阳性结果! 所以这个设计很关键!给一个个人的实验总结希望能帮助大家: 一是受体结合类的直接刺激激活信号通路的方法，一般达到 EMSA 核转运高峰的时间比较短，大概控制在30min-2h 之间， 很多时候都是在45min 和 1h 达到高峰， 当然

2、还有合适的浓度！ ！ ！ 二是是你用的是药物刺激产生受体可能时间会长一些 , 因为药物还有一个渗透和刺激产生细胞因子的过程. 时间可以长一些, 主要根据自己的药物刺激特性确定时间点 .2 . 核蛋白样品的制备;制备蛋白样品的关键是:1.注意用专用的和核蛋白抽提试剂来做,才能使制备的核蛋白保持蛋白原有的天然活性和构像.2. 掌握好核蛋白的浓度和纯度,尤其是浓度. 能入核的蛋白本来就不是很多 ,所以核蛋白的浓度往往不会很高 , 但是 EMSA 试验对核蛋白的浓度要求还是听高的 ! 一般要求在1ug/ul 以上 ! 有时候稍微低于这个数量级也可以 ,但是不能太低,否则影响结合反应拿不到结果. 这就要

3、求核蛋白抽提尽量避免核蛋白的损失.同时 , 一般制备核蛋白的材料为细胞和组织 , 细胞要比组织好做的多 , 最重要的是用细胞得到核蛋白的纯度比组织要高很多 . 而组织抽提后杂蛋白相对较多 !杂蛋白多会影响试验结果不容易得到 EMSA 阳性结果 !3 . 探针的制备:又很多站友都在问我生物素标记到 3端还是 5端,其实我觉得最好还是两端都标记, 这样才能更好的提高灵敏度, 国内的标记技术我还不是很了解,我们这边的探真都是国外定做的 ,还算可以 ,其制作程序如下: 合成寡核苷酸-标记生物素-纯化 -退火合成双链.也是一个比较复杂的过程.4 .EMSA 实验技术 . 这一点主要是操作的细节问题 !

4、下面会更细的谈到 .技术要点 :关于技术要点,我在这里只提一下关键的几点需要注意的细节操作,其他的照正常程序就可以了 !1. 制胶 必须是非变性PAGE凝胶，我们实验室一般用6.5%的非变性胶.制胶很重要 ,直接影响电泳的效果!一般控制在5 分钟凝固的效果.10X TBE 1.0ml40% Acrylamide （40% 聚丙烯酰胺） 3.3ml50% Glycerol （50% 甘油） 1.0mldH2O （蒸馏水） 14.8mlTEMED （四甲基乙二氨） 20dl脱气 10min10% AP （过硫酸氨） 120dl总量 20.0ml2. 一般试剂盒包括的试剂l 10X Binding

5、Buffer (10X 结合反应液) (-20 oC)l Poly (dI:dC) (dI:dC) (聚核苷酸竞争物) (-20 oC)l 6X Loading Buffer ( 10X 上样缓冲液) (4 oC)l Cold oligonucleotides (非标记竞争性寡核苷酸) (-20 oC)l Biotin-Labeled Probe (生物素标记探针) (-20 oC)l Streptavidin-HRP (链霉亲核素 -HRP ) (4oC)l 2 Blocking Buffer (2 x 封闭液)(4 oC)l 5 Washing Buffer (5 x 洗涤液)(4 oC)

6、l Equilibration Solution (平衡液) (4 oC)l Binding-membrane (结合反应膜) (RT)3. 结合反应每次结合反应需1-5d1核蛋白(根据核蛋白浓度而定)，根据不同的核提取物浓度加入核提取物用量，用双蒸蒸储水将终体积调节到15小( 1 ) 结合反应体系：10X结合反应液1.5dlPoly(dI:dC)(dI:dC) 1.0d l细胞核提取物*?dl双蒸水* ?dl混匀室温静置20 分钟生物素标记的探针 0.5dl总量15dl混匀室温静置20 分钟或以上。2 )特异性反应确认竞争反应体系：10X结合反应液1.5dlPoly(dI:dC)(dI:dC

7、) 1.0d l细胞核提取物？dl未标记的竞争性寡核2.0医l双蒸水* ?dl混匀室温静置20 分钟生物素标记的探针 0.5dl总量15小混匀室温静置20 分钟或以上。其中 :探针用量 : 这相当于 10-50fmoles 的 DNA 探针。我们通常是最少50fmol.蛋白样品用量：一般用量在2-20ug(控制在1-5 lg白，总体系15ul.细胞核抽屉物浓度都比较低,组织的一般都比较高 , 因为杂蛋白较多 .poly(dI:dC)(dI:dC): 它由肌苷和胞嘧啶组成。 由于其特定的结构， 可抑制蛋白对标记探针的非特异结合，避免假复合物。 在凝胶迁移反应中加入 poly(dI:dC)(dI:

8、dC) ，可抑制粗制核抽提液中其它 DNA 结合蛋白结合，比如转录调节因子的非特异结合。当用纯化的蛋白作凝胶迁移反应时，不必一定加入 poly(dI:dC)(dI:dC) ，如加入，则普通反应中所用终浓度不超过 50-100ng 。对核 抽提液 : 每 2-3ug 核抽提液用 1 ug poly(dI:dC)(dI:dC) 。未标记的竞争性寡核: 做为竞争的探真来说, 其实就是没有标记的转炉银子的寡核苷酸,用量一般是正常探真的 50-100 倍. 再这里我引申的解释一F其他的对照的含义.常规反应（含激活的目的转录因子白核蛋白十标记探针）；阴性对照反应（核蛋白十标记探针）；阳性对照（核蛋白十标记

9、探针）探针冷竞争反应（含激活的目的转录因子的核蛋白十标记探针十标记探针 100 倍量的未标记探针） ；突变探针的冷竞争反应（含激活的目的转录因子的核蛋白十标记探针标记探针100 倍量的未标记突变探针 ） ； Super-shift反应（含激活的目的转录因子的核蛋白十标记探针十目的转录因子的特异抗体）.4. 预电泳和电泳： 0.25X TBE 在冰上 120V 预电泳 1 小时 ; 务必换掉预电泳的缓冲液,用新的0.25X TB低温下150V,电泳约60分钟。 注意横压电泳的时候注意电流的数字变化 , 记录开始电泳和电泳结束的电流数据的变化 !5. 电转运在 0.5X TBE 中 390mA 电

10、转移 40 分钟 , 注意转运膜的选择, 有一种离子加强型的转运效果比较好 ! 我当初选择过一般的和离子加强型的 , 还是离子加强型结合效果好 !6. 紫外交联 : 正规的应该是紫外交联仪的使用 ,但是很多单位没有交联仪那就用无菌操作台上的紫外等下 10cm 处交联 10 分钟就可以了 ! 这个数据是我做了好多次试验才摸索出来的 !条件比较成熟! 可以借鉴 !7. 化学发光反应包括 Blocking Buffer 30 分钟封闭 , Streptavidin-HRP 标记 , Washing Buffer洗涤 ; Equilibration Solution 平衡 , 这些按照规定操作即可!

11、没有太多的细节,只是注意两点 ,一是期 间结合 膜的表面一定 不能干燥! 二是Streptavidin-HRP 不能加在膜上,而是加在液体中混韵后在将膜放在液体中孵浴 .8. 化学发光图像显示两种方法 : 化学发光数字成像与检测和感光胶片冲印成像操作基本和 Western 试验操作相当 , 只是这个膜是一次性的 ,不能重复使用 , 一定保存好图片 ! 由于跑得是非变性凝胶,蛋白保持天然构想和活性,所以代条很可能是一块一块的而不像WB 那样很规整的一条细线,这个很正常 !希望大家交流讨论!人生最大的幸福，莫过于连一分钟都无法休息零碎的时间实在可以成就大事业珍惜时间可以使生命变的更有价值 时间象奔

12、腾澎湃的急湍，它一去无返，毫不流连 一个人越知道时间的价值，就越感到失时的痛苦 得到时间，就是得到一切用经济学的眼光来看，时间就是一种财富 时间一点一滴凋谢，犹如蜡烛漫漫燃尽 我总是感觉到时间的巨轮在我背后奔驰，日益迫近 夜晚给老人带来平静，给年轻人带来希望 不浪费时间，每时每刻都做些有用的事，戒掉一切不必要的行为 时间乃是万物中最宝贵的东西，但如果浪费了，那就是最大的浪费我的产业多么美，多么广，多么宽，时间是我的财产，我的田地是时间 时间就是性命，无端的空耗别人的时间，知识是取之不尽，用之不竭的。只有最大限度地挖掘它，才能体会到学习的乐趣。 新想法常常瞬息即逝，必须集中精力，牢记在心，及时捕获。 每天早晨睁开眼睛，深吸一口气，给自己一个微笑，然后说： “在这美妙的一天，我又要获得多少知识啊！ ” 不要为这个世界而惊叹，要让这个世界为你而惊叹！ 如果说学习有捷径可走，那也一定是勤奋