第四章基因工程..Convertor

1、第四章 基因工程基因工程(gene engineering)：又称为重组DNA技术，是指将外源基因通过体外重组后导入受体细胞，并使其能在受体细胞内复制和表达的技术。分子克隆(molecular cloning)：是指在体外将制备的DNA片段与载体重组，然后导入受体细胞，并在受体细胞中复制、扩增，以获得该DNA分子的大量拷贝的技术。 第一节 工具酶(限制性核酸酶内切酶；DNA聚合酶；DNA连接酶；碱性磷酸酶；核酸酶S1)一、限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)限制性核酸内切酶(RE)是一类能识别和切割双链DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶。限制酶主要来自于细

2、菌，其切割序列明确，目前商品化的限制酶现有100多种。命名：Hin d Haemophilus influenzae d株流感嗜血杆菌d株的第三种酶第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。三种限制性核酸内切酶的作用：作用IIIIII酶活性核酸内切酶、甲基化酶、ATP酶、DNA解旋酶核酸内切酶核酸内切酶、甲基化酶DN链上的特异识别位点无有有DN链上的特异切割位点无在识别序列内在识别序列外在分子克隆中的重要意义无有无类酶识别序列特点-回文结构(palindrome) -GGATCC-CCTAGG-切口 ：平端

3、切口、粘端切口限制性核酸内切酶的主要用途：在分子克隆过程中切割DNA以获取目的基因片段、切割载体形成切口，使目的基因能插入载体。分析限制性片段长度多态性(RFLP)，用于遗传病的诊断，法医DNA指纹分析等。 用于构建DNA的物理图谱、基因定位及DNA同源性分析等。二、DNA聚合酶DNA聚合酶和Klenow片段；Taq DNA聚合酶；逆转录酶；末端脱氧核糖核苷酰转移酶。DNA聚合酶和Klenow片段：DNA-pol是单一肽链的多功能酶，分子量为103kd，它具有3种酶活性：5，3，聚合酶活性；3，5，核酸外切酶活性；5，3，核酸外切酶活性。用特异的蛋白酶可将DNA-pol水解成小片段和大片段，后

4、者为Klenow片段。 Klenow片段的主要功能有：补齐双链DNA的3，末端，同时可使3，末端DNA标记同位素；在cDNA克隆中，合成cDNA第二链；DNA序列分析。Taq DNA聚合酶：是一种耐热的DNA聚合酶，分子量为65 kd，最佳作用温度是70-80，Taq酶具有5，3，聚合酶活性和依赖于聚合作用的5，3，外切酶活性。Taq DNA聚合酶可用于DNA测序及通过PCR对DNA分子的特定序列进行体外扩增。逆转录酶：是依赖RNA的DNA聚合酶，它以RNA为模板、4种dNTP为底物，催化合成DNA，此过程称为逆转录作用。逆转录酶的功能：逆转录作用；核酸酶H的水解作用；依赖DNA的DNA聚合酶

5、作用。末端脱氧核糖核苷酰转移酶：末端脱氧核糖核苷酰转移酶简称末端转移酶，分子量为60kd，在二价阳离子存在下，催化脱氧核糖核苷酸转移到单链或双链DNA分子的3，末端-OH上。底物是单链DNA或有3，突出末端的双链DNA，需要Mg2+参与；底物是平端或3，凹端的双链DNA，需要Co2+。 末端转移酶的功能主要有：在载体或目的基因3，末端加上互补的同质多聚尾，形成人工粘性末端，便于DNA重组连接。用于DNA 3，末端的同位素探针标记。三、DNA连接酶DNA连接酶包括大肠杆菌DNA连接酶和T4 DNA连接酶两种类型，分子量分别为7500和6000，两者的辅基不同，前者需NAD+，后者需ATP。它们催

6、化的反应也不尽相同，大肠杆菌DNA连接酶只能连接粘性末端，而T4 DNA连接酶既能连接粘性末端，又能连接平末端。 四、碱性磷酸酶碱性磷酸酶的作用是催化去除DNA、RNA或dNTP上的5，-磷酸基团，其主要用途有：除去DNA片段上的5，磷酸，以防自身连接。在使用T4多核苷酸激酶和32P同位素标记前，除去RNA或DNA上5，端的磷酸。五、核酸酶S1核酸酶S1可水解双链DNA、RNA或DNA-RNA杂交分子中的单链部分，其主要作用是除去粘性末端以产生平末端、除去cDNA合成时形成的发夹结构以及分析RNA的茎环结构和DNA-RNA分子的杂交情况。功能：水解双链DNA、RNA或DNA-RNA杂交体中的单

7、链部分。 核酸酶S1 核酸酶S1 核酸酶S1 第二节 载体载体指能携带外源DNA片段导入宿主细胞进行扩增或表达的工具。载体的本质为DNA。制备的目的基因或外源性DNA片段必须与合适的载体连接形成重组体，才能进入受体细胞并进行复制和表达。载体包括克隆载体和表达载体。常用的载体有：质粒、噬菌体、粘粒、酵母质粒和病毒等。载体大都经过改造，如质粒改造后携带某些选择性标记和克隆位点的遗传信息；噬菌体改造后只保留同一种限制酶的单个或两个切点。在常用的克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件(DNA序列)即为表达载体，它不仅可携带外源基因片段进入宿主细胞，而且可在宿主细胞中表达外源基因。载体应具备的特征：能自

8、我复制并具较高的拷贝数。分子量一般<10Kb。 带有遗传筛选标记。 有适当的限制酶切位点，便于外源基因的插入和筛选。载体上具有多个限制酶的单一位点(即在载体其他部位无这些酶的相同位点)称为多克隆位点(multiple cloning sites,MCS)。一、克隆载体：能将载体外源基因在受体细胞中复制扩增并产生足够量目的基因的载体称为克隆载体。（一）质粒载体质粒(plasmid)是指细菌染色体以外的小分子环状双链DNA，能自我复制和表达其携带的遗传信息。质粒的分子量一般为106-108，小型质粒的长度一般为1.5-15Kb。质粒DNA在细菌中的复制有两种类型：严紧型和松弛型。严紧型质粒的

9、复制需要蛋白质合成和DNA聚合酶的存在，它的复制与细菌的复制密切相关，每个细胞只有1-5个质粒。松弛型质粒的复制使用DNA聚合酶，能在没有蛋白质合成的情况下继续复制，每个细胞内存在10-200个以上质粒(高拷贝)，在细胞蛋白质合成及染色体复制停止的情况下，可继续大量扩增至上千份。质粒克隆载体的主要用途：用于保存和扩增< 2Kb目的DNA。构建cDNA文库。目的DNA的测序。作为核酸杂交时的探针来源。pBR322质粒载体：pBR322质粒是由一系列大肠杆菌质粒DNA通过DNA重组技术构建而成的双链克隆载体，长为4.36Kb。它含有一个能保证高拷贝自我复制的复制起始点(Ori)，并装有四环素

10、抗性(Tetr)基因和氨苄青霉素抗性(Ampr)基因供菌落筛选。在这两个抗性基因中分别含有BamH I和Pst I等限制酶的单一酶切位点，用于插入外源DNA片段。如有外源基因的插入，会导致这些标志性基因的失活。pUC18、pUC19质粒载体：pUC系列载体是由pBR322质粒和M13噬菌体重组构建而成的双链DNA质粒载体。pUC18和pUC19质粒长约2.69Kb，除多克隆位点互为相反方向排列外，其它序列均相同。PUC质粒系列还包括pUC8、pUC9和pUC118、pUC119，它们的区别在于MCS的限制酶识别位点数目不同，而每一对pUC质粒的MCS中限制酶识别位点数目相同、顺序相反。 pUC

11、质粒含Ampr，可供菌落筛选。在载体中装入一个来自大肠杆菌乳糖操纵子的DNA片段(lacZ¢基因)，该基因编码b-半乳糖苷酶氨基端的一个片段，IPTG可诱导此片段合成，而此片段能与宿主细胞所编码的缺陷型b-半乳糖苷酶实现基因内互补(a-互补)，形成完整的b-半乳糖苷酶。 b-半乳糖苷酶能催化指示剂底物5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖苷(X-gal)形成蓝色菌落。pUC载体的lacZ¢基因中含有MCS，当外源基因插入MCS，lac a-肽基因阅读框架被破坏，细菌内将无b-半乳糖苷酶活性，菌落呈白色(即半乳糖苷酶的蓝白斑筛选实验)。（二）噬菌体载体噬菌体(bacteri

12、ophage, phage)：指感染细菌的病毒。按其生活周期分为两种类型：溶菌性噬菌体和溶原性噬菌体。溶菌性噬菌体：指噬菌体感染细胞后，连续增殖，直到细菌裂解，释放的噬菌体又可感染其它细菌。溶原性噬菌体：指噬菌体感染细胞后，可将自身的DNA整合到细菌的染色体中去，和细菌染色体一起复制。l噬菌体：野生型的l噬菌体是线性双链DNA，全长48.5Kb，其中60%(约30Kb)是溶菌生长所必需，中间40%的区域为非必需，可被外源DNA片段代替而不影响l噬菌体的生存。l噬菌体5¢末端含12核苷酸的互补单链顺序，是天然的粘性末端，称为cos位点，l噬菌体感染宿主菌后，其粘端通过碱基配对而结合，形

13、成环状DNA分子。l噬菌体的用途主要有：用作一般的克隆载体；用于构建基因组或cDNA文库(<22Kb)；用于抗体库或随机肽库的构建；核酸的序列分析。重组噬菌体筛选标记：外源基因插入型：蓝白斑(LacZ)筛选外源基因置换型：噬菌斑数目（red和gam基因，转染率高100100倍）M13噬菌体：M13噬菌体含一约6.4Kb的单链(正链)闭环DNA分子。M13噬菌体在细菌内呈溶源状态生长，成熟的子代噬菌体中只有一条含外源DNA的链(负链)。改造过的M13噬菌体引入了带有大肠杆菌LacZ的调控序列和N端部分氨基酸的编码信息以及多克隆位点序列，因此也可用蓝白斑筛选重组体。M13噬菌体载体主要用于目

14、的DNA的测序和单链放射性探针的制备，克隆的外源DNA一般<1Kb。M13噬菌体特点：野生型M13噬菌体为6.4Kb左右的闭环正链DNA分子。克隆的外源基因片段<1kb。M13噬菌体能以单链和双链两种方式存在，可用于感染(经包装的单链DNA)和转化(双链DNA)。M13中引入的多克隆位点，正好插入LacZ基因内，可利用蓝白色噬菌斑筛选重组体。M13噬菌体只降低宿主细胞的生长速度，而不溶解宿主细胞(呈溶源状态生长，故可从细菌培养液中获得噬菌体，制备单链DNA)。黏性质粒(cosmid)黏性质粒是由质粒和l噬菌体的cos位点构建而成。它含有质粒复制的起始位点(ori)、携带抗药基因、用

15、于插入目的基因的单一酶切位点以及l噬菌体的cos位点。黏粒载体的特点： 粘粒载体大小为4-6Kb，而插入外源基因长达40-50kb。加入l噬菌体头部和尾部蛋白，可将粘粒包装成类似于l噬菌体的具感染能力的颗粒，容易进入大肠杆菌。粘粒进入细菌后则完全失去噬菌体的功能，而表现质粒的特性。用途：克隆大片段DNA；构建基因组文库。酵母细胞中克隆基因常用载体 酵母人工染色体(yeast artificial chromosome, YAC)是利用酵母染色体DNA和大肠杆菌pBR322改造而成，可以插入长达1000 Kb的外源DNA片断。根据其复制方式不同分为三型：整合型(YIP)、复制型(YRP)和附加体

16、型(YEP)载体，其中YRP型质粒中插入酵母着丝粒区，构成酵母着丝粒质粒(YCP)载体。三类载体的共同特点： 能在大肠杆菌中复制，并具有较高的拷贝数； 含有在酵母细胞中便于选择的遗传标记； 含有合适的限制酶切位点，以便插入外源基因。 YIP和YCP载体能稳定遗传但都是单拷贝、转化率低，多用于遗传分析；而YRP和YEP载体对酵母具有很高的转化活性、拷贝数较高但稳定性差，后者较前者稳定，是基因克隆中常用的载体。 动物细胞基因克隆的载体 已构建并经常使用的动物病毒克隆载体有：猿猴空泡病毒40(SV40)载体；腺病毒载体；逆转录病毒载体。二、表达载体表达载体是指能将外源基因在受体细胞中有效转录和正确翻

17、译的载体。外源目的基因在新宿主细胞中是否克隆成功，是通过鉴定克隆是否表达的方法来证实，即产生克隆基因所编码的蛋白质，其每个环节都至关重要。真核基因在原核细胞中表达需要有效转录及一系列调控元件(如强启动子及两侧的调控序列、目的基因表达的正确阅读框架、终止子等)，必须保证外源基因插入方向的正确性，插入的外源基因必须受受原核启动子的控制，并且外源基因必须能在大肠杆菌中有效转录和有效翻译。基因表达、合成有功能的蛋白质依赖于基因的有效转录、mRNA正确的翻译和翻译后加工。为了判断某一待测DNA序列的生物活性，常采用报告基因(reporter gene)方法。报告基因：是指处于待测基因下游并通过转录和表达

18、水平来反映上游待测基因功能的基因，又称报道基因。（一）原核细胞表达载体原核细胞的表达载体主要是大肠杆菌表达载体。外源基因在原核细胞中表达需要重要调控元件。大肠杆菌表达载体是在克隆载体的基础上导入表达系统调控元件：启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号。启动子(promoter)：大肠杆菌表达载体中常用的启动子有乳糖启动子(Lac)、色氨酸启动子(Trp)、人工构建的Tac启动子(Trp-Lac)以及噬菌体PL和PR启动子等。SD序列：SD序列是核糖体RNA的识别与结合位点。终止子(terminator)：终止子：一个基因的3，末端有一特定的DNA序列，它具有被RNA聚合酶识别并停止转录

19、的功能。该序列含有一段富含A/T和富含G/C的回文对称结构，终止子转录后形成的RNA具有茎环状局部二级结构。外源基因在原核细胞中的表达载体大致可分为三型：非融合型表达载体：如pKK223-3。 分泌型克隆表达载体：如PINlll系统融合型表达载体如pGEX系统（二）哺乳动物细胞表达载体真核表达载体的真核表达元件有：启动子/增强子克隆位点终止位点和加poly A信号。(1)原核DNA序列：包括能在大肠杆菌中自身复制的复制子和抗药基因的筛选标记。 (2)启动子：转录起始位点上游25-30bp有富含AT的TATA框，TATA框的上游约100-200bp处为上游启动子元件。(3)增强子：是一类显著提高

20、基因转录效率的顺式作用元件。(4)终止子和加polyA信号三、穿梭载体穿梭载体：既能在原核细胞中复制、又能在真核细胞中复制，在原核和真核细胞分子克隆中均能应用的载体称为穿梭载体(shuttle vector)。 （一）穿梭黏粒载体穿梭粘粒载体能携带真核DNA片段在细菌内扩增，并通过转染进入哺乳动物细胞进行转录和表达。这类载体常用于研究目的基因表达调控的组织细胞特性以及它所编码蛋白质的功能，也可从粘粒基因组文库中筛选出特殊功能基因。（二）酵母穿梭质粒载体酵母复制型载体是穿梭质粒载体，它由酵母DNA片段插入到大肠杆菌质粒中构建而成，除有细菌质粒复制子和抗药性标记外，还有酵母DNA片段提供的选择标记

21、，同时又携带了自主复制顺序，由于该载体同时含有大肠杆菌和酵母的自主复制基因，故能在两种细胞中存在和复制。 另外，由噬菌体、质粒与SV40病毒DNA元件也可构建成穿梭载体，Pac10重组病毒-质粒载体也是穿梭载体。第三节 分子克隆的基本步骤分子克隆技术的基本步骤：目的基因的获取；载体的选择；目的基因和载体的酶切与连接；重组DNA导入受体细胞；重组体的筛选和鉴定；即分、切、接、转、筛等过程。一、 目的基因的获取目的基因：指被研究的某一基因或DNA序列，即需要克隆或表达的基因。目的基因的制备方法有：从基因文库中获取、逆转录法、人工合成DNA片段以及直接从染色体DNA中分离目的基因。（一）从基因文库中

22、获取基因组文库(genomic library, G-文库)是指含有某种生物全部基因随机片段的重组DNA克隆群。构建基因组文库时，先将原核或真核细胞染色体DNA提纯，通过机械或酶切使之成为一定大小的片段，将其与适当的载体相连接，经体外包装、转染细菌，得到一组含不同DNA片段的重组噬菌体颗粒。这个文库中含有基因组内全部基因片段，是一个贮存基因组全部序列的信息库，故称为G-文库。真核细胞G-文库DNA中含有较多的重复序列与内含子，一个单拷贝基因只占基因组的10-7 -10-5；而在C-文库中，平均一个目的基因所对应的 mRNA占总mRNA的10-4-10-3，相比之下后者比前者在含量上提高了2-3

23、个数量级，便于提取一个目的基因。转染(transfection)是指以噬菌体、病毒或以它为载体构建的重组子导入细胞的过程。如以细胞全部mRNA经逆转录，制备出全套cDNA建库，则称为C-文库。（二）逆转录法本法是应用得最多的获取目的基因的方法。但前提是目的基因的序列已知，至少部分已知。选用富含目的基因mRNA的细胞作为实验材料，有利于分离到目的基因。如胰岛素基因的mRNA主要存在于胰腺组织，血红蛋白基因的mRNA占网质红细胞总mRNA的50%-90%。用此法得到的目的基因进行克隆可获得较完整的连续编码顺序，易在宿主细胞中表达及筛选。 （三）人工合成DNA片段根据已知某种基因的核苷酸序列或某种基

24、因产物的氨基酸序列，可推导出为该多肽编码的核苷酸短序列，再用DNA合成仪人工合成目的基因。此法适用于合成分子量较小的目的基因 (100bp以内)，如：人生长激素释放因子、血管加压素、干扰素、胸腺素及胰岛素原的基因等。（四）直接从染色体DNA中分离目基因根据染色体DNA的限制性内切酶图谱，用适当的限制性内切酶切割染色体DNA、分离目的基因。本方法较适用于制备原核生物目的基因，其原因为：真核细胞染色体DNA有丰富的内含子，它们在原核细胞中转录后不能被剪接。真核细胞的基因多数为单拷贝，难以分离到足够量的目的基因。 二、 载体的选择l噬菌体和粘性质粒载体常用来构建基因组文库，构建cDNA文库和克隆较小

25、DNA片段常用pUC系列等质粒，M13噬菌体则用于克隆一些待测的DNA序列。三、 目的基因和载体酶切与连接黏性末端连接：本法适用于在质粒和目的基因上有相同单或双酶切位点平末端连接：质粒和目的基因上没有相同的酶切位点；人工接头 通过同聚尾连接：四、重组DNA导入受体细胞 细胞膜结构改变、通透性增加并具有摄取外源DNA能力的细胞称谓感受态细胞(competent cell)。以质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程称为转化(transformation)。五、重组体的筛选和鉴定（一）遗传标记表型特征筛选抗生素抗性标记筛选 因大多数质粒载体带有抗生素抗性标记的特征(如Ampr、Tetr等)

26、，当带有完整抗性基因的载体转化无抗性细菌后，被转化的阳性菌获得抗生素抗性基因而存活并形成噬菌斑，未转化菌不能存活，但应排除未重组的空载体。 双抗生素筛选法：某些质粒载体如 pBR322质粒中装有Ampr和Tetr抗性基因，在含四环素和氨苄青霉素的平皿上都能够生长的细菌只含有空载体，此筛选方法称为双抗生素对照筛选。 -半乳糖苷酶基因失活筛选(蓝白斑筛选)营养标记选择 当细胞生物合成途径中某个酶的编码基因失活后，该细胞成为营养缺陷型，如导入细胞的重组DNA能弥补缺陷的基因，那么，培养基中就不需补充有关的营养成分，由此可挑选出含重组DNA的阳性细菌。（二）重组子结构特征的筛选重组子大小鉴别筛选：从挑选的菌落中分别提取重组载体DNA和原载体DNA，用一种限制酶切消化后直接进行电泳，重组载体DNA因分子量较大而迁移率较小。酶切鉴定：根据已知外源基因两端的酶切位点，分别用相应的两种内切酶进行切割，经琼脂糖凝胶电泳后，可根据DNA mark来分析插入DNA片段的分子量。PCR筛选法 核酸杂交技术筛选：将DNA的克隆片段或转化细菌平板转移至硝酸纤维素薄膜上，应用特异性的核酸探针对其进行原位杂交，可筛选出阳性克隆。另外，还可通过斑点杂交和Southern blot杂交技术筛选