实验三细菌纯种分离、培养和接种技术

1、实验三细菌纯种分离、培养和接种技术一、实验目的(1) 了解和学习水中细菌总数和大肠菌群的测左原理和测左意义。(2) 学习和掌握用稀释平板讣数法测左水中细菌总数的方法。(3) 学习和掌握水中大肠菌群的检测方法。二、实验原理水的微生物学的检验，特别是肠道细菌的检验，在保证饮水安全和控制传染病上有着重 要意义，同时也是评价水质状况的重要指标。国家饮用水标准规泄，饮用水中大肠菌群数每 升中不超过3个，细菌总数每mL不超过100个。它反映的是检样中活菌的数量。所谓大肠菌群，是指在37°C24h内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革兰氏阴性无芽 胞杆菌的总称。水的大肠菌群数是指100mL水检样内含

2、有的大肠菌群实际数值，以大肠菌 群最近似数(MPN)表示。水源中大肠菌群的数疑，是直接反映水源被人畜排泄物污染的一项 重要指标。目前，国际上已公认大肠菌群的存在是粪便污染的指标。因而对饮用水必须进行 大肠菌群的检查。水中大肠菌群的检验方法，常用多管发酵法和滤膜法。多管发酵法可运用于各种水样的检 验，但操作繁琐，需要时间长。滤膜法仅适用于自来水和深井水，操作简单、快速，但不适 用于杂质较多、易于阻塞滤孔的水样。三、实验材料1、菌落总数的测定:1) 培养基：牛肉膏蛋白陈琼脂培养基，无菌生理盐水。2) 器材：火菌三角瓶，火菌的具塞三角瓶，火菌平皿，火菌吸管，火菌试管等。2、大肠菌群的测左：1)培养基

3、： 乳糖胆盐蛋白陈培养基：蛋白丿冻20g,胆盐(或牛、羊胆盐)5g,乳糖10g, 0.04%浪甲酚紫水溶液25mL,水lOOOmL, pH7.4o制法：将蛋白腺、胆盐、乳糖溶于水中，校正pH,加入指示剂，分装，每瓶50mL或每 管5mL,并倒置放入一个杜氏小管，1219灭菌15mino 伊红美蓝琼脂培养基：制法：将伊红美蓝琼脂粉溶于水中，校正pH后分装.121°C火菌15min备用。平板划线法：接种是采用平板划线的方法将初发酵的大肠杆菌进行接种。四、实验方法1、水样的采集：1）自来水：先将自来水龙头用洒精灯火焰灼烧灭菌，再开放水龙头使水流5min.以火菌 三角瓶接取水样以备分析。2）

4、池水、河水、湖水等地而水源水：在距岸边5m处，取距水而10-15cm的深层水样，先 将火菌的具塞三角瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛 满后，将瓶塞盖好，再从水中取岀。如果不能在2h内检测的，需放入冰箱中保存。2、细菌总数的测左：1）水样稀释及培养： 按无菌操作法，将水样作10倍系列稀释； 根据对水样污染情况的估计，选择2-3个适宜稀释度（饮用水如自来水、深井水等，一 般选择k 1:10两种浓度；水源水如河水等，比较淸洁的可选择1:10、1:100、1:1000三种 稀释度；污染水一被选择1:100、1:1000. 1:10000三种稀释度），吸取ImL稀释液于火

5、菌平 皿内，每个稀释度作3个重复。 将熔化后保温度45°C的牛肉膏蛋白腺琼脂培养基倒平皿，每皿约15mL,并趁热转动 平皿混合均匀。 待琼脂凝固后,将平皿倒置于37°C培养箱内培养24±lh后取出，计算平皿内菌落数目， 乘以稀释倍数，即得ImL水样中所含的细菌菌落总数。2）计算方法：作平板计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落 数后，求岀同稀释度的各平板平均菌落数。3）计数的报告:选取菌落数在30-300之间的平板作为菌落总数测左标准。一个稀释度使用两个重复时, 应选取两个平板的平均数。如果一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，

6、而应以无片 状菌落生长的平板汁数作为该稀释度的菌数。若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌 落分布又很均匀，可计算半个平板后乘2以代表整个平板的菌落数。纽I菌的菌落数在100以内时，按其实有数报告；大于100时，用二位有效数字，在二位有 效数字后而的数字，以四舍五入方法修约。为了缩短数字后面的0的个数，可用10的指数 来表示。3、大肠菌群的测左（多管发酵法）：初步发酵试验:在10支装有10mL的乳糖胆盐的发酵试管中（内有倒置小管），以无菌操作各加入稀释后的 水样ImL。摇匀后，37°C培养24h。平板分离：经24h培养后，将产酸产气及只产酸的发酵管（瓶），分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板 （EMB培养基）上，37°C培养1824h.大肠菌群在EMB平板上，菌落呈紫黑色，具有或略 带有或不带有金属光泽，或者呈淡紫红色，仅中心颜色较深；挑取符合上述特征的菌落进行 涂片，革兰氏染色，镜检。 复发酵试验：将革兰氏阴性无芽胞杆菌的菌落的剩余部分接于单倍乳糖发酵管中，