鸭感染鸭疫里氏杆菌肝脏基因差异表达的研究-精品

1、 密级:分类号:华中农业大学硕士学位论文鸭感染鸭疫里氏杆菌肝脏基因差异表达研究陈志虎研究生毕丁仁教授指导教师指导小组 毕丁仁教授李自力副教授石德时副教授王喜亮副教授研究方向:兽医微生物与免疫学业:预防兽医学专获得学位时间: 年月授予学位名称:农学硕士华中农业大学动物医学院二零一一年六月华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书学位论文年.月琶是否保密如需保密,解密时间独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究作及取得的研究成果.尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人巴经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用

2、过的材科。指导教师对此进行了审定.与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明。并表示了谢意.时同:知研究生签名:磁,志如年。占月叮日.学位论文使用授权书本入完金了解华中农业大学关予保存、使用学位论文的规定,印学生必须按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本;学校有权保存提交论文的印刷版和电子版,并提供目录检索和阅览服务,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文.本人同意华中农业大学可以用不同方武在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容.同时本人保留在其他媒体发表论文的权力.注:保密学位论文牵涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在蘅要提交保密的论文在解

3、密后适用于本授权书.学位论文作者签名:能志施导师签名:咖签名日期:知,年口占月呷日 签名日期:,年月尸日注:谤将本表赢接装订在学位论文的靡页和目录之间鸭感染鸭疫里氏杆菌肝脏基因差异表达研究目录摘要第一章 文献综述?.鸭疫里氏杆菌病的研究进展.病原学研究进展?. 的分类与形态结构.的生长及生化特征?. 的血清型。.临床病理学.临床剖检症状?.组织病理学?.实验室诊断研究进展.细菌的分离与鉴定一.凝集试验与琼脂凝胶免疫扩散试验?.荧光抗体法。.间接检澳?.检测?.间接血凝试验.间接免疫酶组织化学法.预防与治疗.药物防治?。.疫苗防治?。差异表达基因克隆研究进展?.差异表达基因克隆现状.抑制行消减杂

4、交技术的原理与方法.抑制行消减杂交技术的优点?.第二章鸭感染鸭疫里氏杆菌肝脏差异基因的筛选与鉴定?。研究的目的与意义试验材料.华中农业大学届硕士研究生学位论文.主要仪器.主要试剂一.主要溶液的配制.抗生素类?.细菌培养基.质粒抽提相关溶液.感染菌株与试验动物?。.引物.试验方法.试验鸭人工感染与病料的采集?.组织总的提取.的分离.差减文库的构建.和的制备?一.差减杂交?.扩增?. 的接头连接效率的检测?.差减文库的差减效率的检测?.差减质粒文库的构建.差减克隆的筛选. 筛选.斑点杂交筛选.阳性克隆片段测序及序列分析?. 检验差异表达基因结果与分析?一.鸭肝脏总提取.鸭肝脏的分离?. 和的制备.

5、差减文库接头效率检测.鸭感染鸭疫里氏杆菌肝脏基因差异表达研究.鸭感染肝脏差异表达基因差减文库的构建?.差减文库的差减效率检测?.差减文库的差减效率检测.差减克隆的筛选?.筛选.斑点杂交筛选?.阳性克隆片段测序及序列分析?.通过 对鸭感染肝脏差异表达基因的验证.讨论.急性期反应?。.炎症和免疫反应?.损伤修复?.结论.参考文献?.鸭感染鸭疫里氏杆菌肝脏基因差异表达研究摘要鸭疫里氏杆菌病是对养鸭业危害最为严重的疾病之一,并能在多种禽类中传播,如鹅、火鸡等,其主要特征表现为急性败血症和浆膜纤维性渗出。目前国际上公认的鸭疫里氏杆菌血清型有种,各型之间无有效地交叉免疫保护,这给使用疫苗进行该病的防治带来

6、了诸多困难。鸭疫里氏杆菌病给全世界养鸭业带来了严重的经济损失,但人们对其毒力因子以及致病的分子机理,尤其是宿主对感染的应答反应还缺乏深入认识。本研究利用抑制消减杂交技术构建了鸭疫里氏杆菌感染过程中鸭肝脏组织差减文库,通过和斑点杂交筛选到个在鸭疫里氏杆菌感染过程中鸭肝脏组织差异表达的基因,这些基因的功能分为急性期反应、炎症反应、免疫和防御应答、损伤修复以及其他功能。利用 对其中个基因的在感染过程中不同时间段 、 和 表达水平进行了验证,结果表明这些基因在鸭疫里氏杆菌感染过程中表达水平都有不同程度的上调或下调.或.。试验结果表明,鸭疫里氏杆菌感染引起鸭肝脏的一系列反应,包括急性期反应、炎症反应、免

7、疫应答以及损伤修复等,通过对这些基因的差异调节,一方面维持机体的内环境平衡状态,另一方面启动机体的免疫系统识别和抵抗病原菌的侵袭。本试验初步揭示了鸭对鸭疫里氏杆菌感染的应答反应,为进一步阐明鸭疫里氏杆菌感染的致病机理提供了基础,下一步研究需要确定相关的基因在免疫应答反应和抗病机制中的作用。关键词:鸭疫里氏杆菌:肝脏:抑制性消减杂交技术:基因表达;抗病性华中农业大学 届硕士研究生学位论文 嘶.。 砸 . ,.见 足 . , ,. ?.乙. . . , , , .,. 足、,】.: ; ;?一一堕壁銎堕垄里墨堑堕墅壁茎里茎墨耋垄堡壅?一缩略语表中文全称英文全称缩写名称氨苄青霉索碱基对互补菌落形成单

8、位酶联免疫吸附试验信使核糖核酸光密度磷酸盐缓冲液鸭疫里氏杆菌每分钟转数核糖核酸酶逆转录聚合酶链式反应.十二烷基硫酸钠抑制性消减杂交技术胰酶大豆琼脂胰酶大豆肉汤鸭感染鸭疫里氏杆菌肝脏基因差异表达研究第一章文献综述 弟一早义陬琢途鸭疫里氏杆菌病的研究进展鸭疫里氏杆菌病 又称鸭传染性浆膜炎、鸭疫综合症、新鸭病、鸭疫败血症,曾被命名为鸭疫巴氏杆菌病已取消该命名,是由鸭疫里氏杆菌,黜感染鸭、鹅、火鸡及其它禽类所引起的一种接触性、急性或慢性、败血性传染病。该病的主要临床症状是纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎和脑膜炎高福和苏敬良,以及部分病例出现关节炎、结膜炎、干酪样输卵管炎,。本病主要感染周龄的雏鸭,周龄尤

9、为严重,致死率不一,高者可达%以上,耐.,因此过鸭成为僵鸭,饲料转化率低、生长迟缓,生产性能下降它是危害当前养鸭业的主要传染病之一。本病分布广泛,在许多国家均有发生。在我国,年由邝荣禄等首次提出本病在我国的存在,并于年确诊了本病在广东的存在和流行;此后,年郭玉璞在北京、年郭予强在广东、年林业杰在福建、年林世堂等在福建、年程安春等在四川、年鲍国连等与罗东生等分别在浙江和湖南、年陈兴生等在海南、张大丙和郭玉璞在上海和河北、苏敬良等在河南、年李家奎等在湖北、李继祥在重庆、房宝志等在山东、年王春霞和王林川在广东、蔡家利等在重庆、胡清海等在安徽、胡清海等在江苏、吴礼洁和陈泽祥在广西、年黄瑜等在福建、温娟

10、等在广西、曲永生等在黑龙江、年李自力等在湖北、梁月丽和陶海静在河南、年杨建远在江西、年范京惠等在河北均分离到鸭疫里氏杆菌。.病原学研究进展. 的分类与形态结构在伯杰氏细菌学鉴定手册的第七版中将其命名为鸭疫巴氏杆菌,分类地位暂未定;而在第八版和第九版中则将其列为未定种。通过不同手段,证明本菌与莫拉氏菌属和巴氏杆菌属不是同一型,如通过比较超微结构郭玉璞等,。根据蛋白质、杂交分析、结构与表形特征等,建议将该菌划分在里氏杆菌属.,为纪念在年首次报道了“鹅渗出性败血症,特华中农业大学 届硕士研究生学位论文将其命名为鸭疫里氏杆菌,并得到广泛采纳。为革兰氏阴性杆菌,其大小变化较大,一般为宽.,长 .,偶有长

11、丝状,多数单个存在,也有少数的呈链状,无鞭毛,无运动性,无芽孢,有荚膜。瑞氏染色呈两极着染,印度墨汁负染可见荚膜。菌体的超薄切片下有的还可见其顶端或侧面有类似细胞壁的芽状赘生物,其内部有类似菌体的结构。.的生长及生化特征在致死鸭的脑、心血、肝等各脏器及病变部位都有可分离到,其中以脑的分离率最高,约为%;其次是心血,约为%;而肝、脾等脏器分离率只有%左右郭予强,。本菌对营养要求较高,在普通琼脂、麦康凯琼脂、伊红美蓝琼脂及琼脂上均不能生长,在巧克力营养琼脂平板、胰酶大豆琼脂、血液琼脂平板等固体培养基以及胰蛋白肉汤、胰酶大豆肉汤、胰蛋白葡萄糖硫胺素肉汤等液体培养基上生长良好。有对营养要求特别苛刻的需

12、加入%小牛血清和.%酵母浸出物。提供%的的环境时生长更为茂盛。在含%的的温箱中下培养 ,在平板上可长出圆形、边缘整齐、光滑、突起,乳白色、直径 左右的粘稠菌落,当迎着斜光观察时可见菌落发绿光,不同菌株绿光的深浅不同;在巧克力营养琼脂平板上与在上生长的菌落相似;在血液琼脂平板上可生长成奶油状、有闪光的菌落,不溶血。的血清型不同生长速度也有所差异,型生长最快, 后即可长成可见菌落,而型最慢。在含血清或酵母浸出物的肉汤中,培养 后,可见肉汤中有上下均一的轻微浑浊,而管底有少量沉淀。的生化试验报道的结果不尽相同,较为一致的有 不发酵糖类,如葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、甘露糖,也不水解淀粉。在葡萄糖、麦芽

13、糖、糊精、果糖、甘露糖和海藻糖等单糖缓冲培养基中生长可产酸。多数的菌株对于触酶试验、明胶液化试验、过氧化氢酶试验、尿素酶分解试验为阳性,而试验、枸橼酸盐利用试验、试验、硫化氢试验、硝酸盐利用试验等为阴性。磷酸酶、磷胺酶、酯脂酶、胱氨酸.芳香酰胺和亮氨酸酶的活性均为阳性。硫酸软骨素酶、透明质酸酶和七叶苷水解酶为阴性。部分菌株产生精氨酸双水解酶和尿素酶。但根据报道的结果又不尽相同,可能不同的血清型的菌株,甚至血清型相同但菌株不同的生化试验的结果也可能存在差异,故生化试验只能对进行辅助鉴定。鸭感染鸭疫里氏杆菌肝脏基因差异表达研究和对理化因素的抵抗力不强。有报道在垫料中和自来水分别存活,但奇怪的是在固

14、体培养基上室温条件下绝大多数的细菌存活仅达到一,在肉汤培养物中条件下也只可存活周。邓治邦等试验证明,条件下保存在肉汤中的菌液 后的致病力便下降%以上。在下作 后便全部失活。吕殿红等采用抗凝鸭血将保存在.条件下,其毒力及活力可保持个月以上。鄢志强等报道用甘油生理盐水低温条件下可长期保存鸭疫里氏杆菌。鉴于此,最好将冻干后保存在低温条件下。.的血清型随着对血清型研究的逐步深入和完善,目前国际比较公认的有种血清型,这种血清型的参考株依次是:,.,.,.,一,一,?./,/,/,/,/,/。对&恤清型的研究仍在继续发展中,不断有新的血清型被发现和报道。对于血清型的鉴定主要有种方法:玻片凝集试验、

15、琼脂扩散试验和试管凝集试验,它们之间既有相关性,又各有优缺点。玻片凝集试验简单易行、结果判定快,但容易出现交叉反应,适合做大规模的快速筛选,初步筛选后还需用其它两种方法进一步鉴定。试管凝集试验的交叉反应现象也较严重,但可以将分离株与参考株作凝集效价对比而最终定型,当它们的效价相差在个滴度及以上时基本可定为两型不同,而效价相差在个滴度及以内时基本可定为同型,当然,这也不是绝对的。琼脂扩散试验的交叉反应较弱,对确立菌株之间的抗原相关性有利。但敏感性低,所以较高效价的抗血清是必须的,若抗血清的抗体效价过低,则即使用同一菌株免疫出的抗血清与该抗原之间进行沉淀反应,其结果也相当微弱。因此,这种方法各有利

16、弊,只有将它们有效结合,才能得出可靠的结果。经过选择合适的分型方法而最终确立的各型之间无交叉反应或极微弱,也缺乏交叉保护。世界各地流行的的血清型不尽相同:等报道在年的美国主要流行株为、型;报道在年的丹麦的流行株主要是型和型;报道在年的英国主要流行株是型和型;等报道年的泰国主要流行株为型。即便是同一国家和地区在不同时期的流行株的血清型有时也会有差异:年,丹麦的主要流行株为型和型;而在年,除上述两型外华中农业大学届硕士研究生学位论文还出现了、和型;到了年却仅发现感染菌株只为型,其它型的很少。韦强等报道,我国的主要流行株在年以前绝大部分为型,到了年型只占.%,而在年型却达至.%,占绝对优势。在我国,

17、的流行株也随时间和地点的不同有所不同,与当时的研究水平也有一定关系。年,高福等对其所分离到的多株蹦行了血清学鉴定,认为都属于型。年,张大丙等发现我国存在的血清型不仅仅只有型。年,是我国研究血清型与国际研究接轨的一年:张大丙等对其在我国分离到与国际标准株进行了血清学上的比较研究,证实我国的血清型有、型,其中,北京地区所分离到的的株属于种血清型,上海地区所分离到的株属于种血清型,河南省所分离到的株属种血清型。同年,苏进良等在河南和北京分离到株,尽管它们的生化特性和致病性与型相似,但它们不属于型和型,使用型和型的油乳灭活苗也不能很好地保护当地的发病鸭群。年,程安春对在年之间所分离出株,重新进行了系统

18、的血清型分型,发现它们分属个血清型,其中有个不属于已知的种血清型,并将其命名为.型。之后,汪铭书和程安春将其在年间来自全国个省、自治区所分离到的脚行了血清学鉴定,其中株为型、株为型、株为型和株为型。年,张大丙等对其从年以来所分离到的多株进行了血清型鉴定,结果鉴定出个血清型:、型,其中的种血清型占到总分离株的%,是主要流行的血清型:、型。以上学者的研究表明,我国所存在的血清型多而分布复杂,并可能还存在其它的血清型,这给交叉保护力极低的防疫工作带来极大的困难。.的分子生物学研究概况的质粒命等首次研究发现大部分菌株中含有质粒,并将其中.名为,且获得了全序列,包含个长的开放阅读框,即、及,其中,认为、

19、编码的蛋白质与毒力有关,且已证实等还报道了.的质粒序列仅在含质粒的菌株中存在。全序列,包含个大,其中个编码的多肽时毒力相关蛋白。等对株编码的 基因序列进行相似性分析,发现其同源性高达%.%,用对 进行分析,发现即使是同一血清型鸭感染鸭疫里氏杆菌肝脏基因差异表达研究的不同菌株,其 仍存在差异。曲丰发等用对的参考基因进行分菌株、同一血清型的不同菌株、变异株及可能的新型菌株的的产物进行 酶切来鉴定分离株。析,结果显示,可以对蔡畅等对个不同血清型、亚型、变异株和未定型的菌株一,设计相应的引物进行扩增,结果显示基因的单链构象多态性分析可以对进行分类鉴。对的免疫原性研究主要在荚膜蛋白和外膜蛋白上。苏敬良等

20、研究了型荚膜提取物的免疫原性,发现用荚膜粗提物与经苯酚抽提纯化后的荚膜提取物免疫鸭后对同源细菌的攻毒保护率分别为%和%,且免疫后刺激机体产生抗体的水平也存在差异,即抗体水平荚膜粗提物免疫组高于纯化后免疫组,且前者抗体下降速度比后者慢。程安春等对血清型的采用超声裂解和超速离心方法来提取其外膜蛋白,并对该外膜蛋白使用.电泳分析,结果显示血清型的外膜外膜蛋白可以与用它免疫蛋白是由条多肽组成,之后用免疫印迹证实其过的鸭的血清发生较强的抗原抗体反应,说明它是主要的免疫原蛋白之一,用弗氏佐剂乳化分离得到的外膜蛋白制成的亚单位疫苗免疫雏鸭后,产生了较强的抗体。朱德康对提取的种血清型外膜蛋白用.技术分析,表明

21、外膜蛋白的电泳图谱具有一定相似性,并对外膜蛋白抗原进行免疫印迹,结果表明种血清型外膜蛋白均具有免疫原性,且存在多种免疫原性的外膜蛋白成分。等对用种限制性核酸内切酶进行指纹图谱研究发现,用或 消化的染色体,其指纹图谱清晰可见,且不同来源的,即使是同一地区同一禽类分离到的,其指纹图谱也有所不同。等通过重复序列,对标准株和种不同血清型的株进行分子指纹图谱研究,发现不同血清型之间的指纹图谱有很大的差别,且在同一血清型中也存在多态性。.临床病理学.临床剖检症状,但按病程发展的速度,一般分为最急性、急性和慢性本病一般的潜伏期为三种。最急性病例死亡迅速,死前看不到任何明显症状。急性病例最多见,对鸭群造成的损

22、失也最大,周龄的雏鸭常见,病程一般为。慢性病例在“周龄华中农业大学 届硕士研究生学位论文的鸭中多见,病程周或周以上,偶有耐过鸭,但生长发育受阻。急性和慢例中有很多相同的症状,主要表现为食欲不振,精神沉郁、腿软伏地,不愿下眼鼻分泌物增多,呼吸受阻、咳嗽,排黄绿色或黄白色稀粪,味恶臭,运动失调,头颈震颤,严重的则头颈歪斜,部分病鸭关节肿大、跋行。临床剖检症状以“三炎为主,即肝周炎、心包炎和气囊炎这与鸡的大肠杆菌感染有些相似,主要是由于全身浆膜表面的纤维素性渗出而引起。具体病变如下:肝脏:肝上有一层白色假膜,即纤维素性渗出物,易剥离,且肝脏明显肿大,有的可达腹腔后缘,质脆,胆囊肿大。心脏:在急性病例

23、中,病鸭心脏还没来得及形成假膜便死亡,但心包中有积液,病程较长的则心外膜表面有灰白色纤维素性渗出物,病程更长的鸭心包膜与心外膜粘连,其间由淡黄色纤维素填充。气囊:增厚浑浊,尤其以胸气囊和颈气囊较为严重,也由于纤维素性渗引起。脾脏:有的肿大,充血和出血,呈大理石状,表面有纤维素膜。输卵管:成年患病母鸭输卵管增粗,内有条索状干酪样物质。脑:若出现神经症状的,则脑部病变明显,水肿、充血或出血,脑膜炎,少数脑膜上甚至有纤维素性渗出物。皮肤:偶见靠近肛门处的皮肤坏死,在皮下有淡黄色渗出物。.组织病理学感染发病鸭病的组织病理变化除上述有明显临床解剖症状的,如肝脏、心脏、大脑和脾脏外,还有些免疫器官如胸腺、

24、法氏囊和其他器官胡薛英等,。肝脏:肝索结构紊乱,肝窦扩张,肝小叶呈网状,中央静脉与小叶间静脉扩张充血,毛细胆管扩张淤积黄褐色的胆汁。肝细胞肿胀浑浊,脂肪变性、颗粒变性或水泡变性,中空而核被挤到一侧,呈指环状。心脏:血管扩张充血、出血,心肌纤维肿胀,颗粒变性或空泡变性,肌纤维间质水肿,肌纤维问增宽,肌浆内充满红染的细小颗粒,心外膜增厚,其中有单核细胞、淋巴细胞和假嗜伊红白细胞弥漫性浸润。脾脏:脾索结构紊乱,淋巴细胞明显减少;血管扩张充血、出血,血管内皮细胞肿胀:脾窦高度扩张充血出血,散在含铁血红色素的黄褐色颗粒,且见大量炎性细胞浸润、纤维素和浆液渗出物;被膜水肿增厚,有炎性细胞浸润,有大量纤维性

25、鸭感染鸭疫里氏杆菌肝脏基因差异表达研究渗出物:白髓、红髓界限不清,白髓淋巴滤泡减少、缩小,淋巴细胞排列稀疏:严重者淋巴组织灶性坏死。大脑:脑内血管扩张充血,管内有血栓,管壁内皮细胞肿胀,血管周围有淋巴细胞和胶质细胞。脑膜水肿且有纤维素性渗出和炎性细胞弥散性浸润。.实验室诊断研究进展通过观察临床症状、病理变化,同时结合当时的流行病状况,可以进行初步的诊断,但更为准确的诊断,需要通过实验室方法。.细菌的分离与鉴定患鸭疫里默氏杆菌病的鸭的脑、肝脏和心血中含菌量都较高,无菌操作采取这些病变材料,接种于胰酶大豆琼脂平板或巧克力琼脂等培养基上,在含%的的培养箱中下培养 ,观察菌落形态,并对可疑菌落做纯培养

26、。由于该茵在麦康凯和普通培养基上不生长,同时结合生化实验结果,可以初步判定该茵是否为。.凝集试验与琼脂凝胶免疫扩散试验?在血清学中已有介绍,此处略。.荧光抗体法该方法可分为直接荧光抗体法和间接荧光抗体法。直接荧光抗体法特异性强、操作简便、效率高,其大体操作步骤为:取病料涂片、固定、特异荧光染色、镜检。该法可以应用于检测急性病例,在避光条件下涂片标本上可见有带绿色荧光的菌体郭玉璞等,。通过组织中的病原分离及组织涂片抗体染色等证明,病原主要集中于肝脏,并认为细菌的定位及数量直接关系到感染动物的病程。通过比较不同参照菌和不同试验方法对鸭疫里氏杆菌分型的影响,试验结果表明,运用直接荧光抗体法对分离株进

27、行菌种鉴定过程中,野外血清型多样化的影响可以忽略不计张大丙等,。间接荧光抗体法具有种特异性,不具备型特异性.间接检测通过间接方法来检测应用较为广泛。可以用型超声破碎后全菌蛋白或提取型脂多糖作为抗原包被酶标板,建立了检测鸭血清中型抗体的间接方法张鹤晓等,;胡清海等,。很多学者通过将型、型、型、型、型、型超声破碎后的全茵蛋白分别包被酶标板,成功建立了鉴定该华中农业大学 届硕士研究生学位论文种血清型的间接方法程安春,:张冬冬和张大丙,。通过方法检测发现,至少有种血清型的菌株中含有一种表面抗原蛋白,提示该蛋白可能在各种血清型中广泛存在,可以通过该蛋白来建立血清血检测方法;通过试验证明,将表面抗原末端片

28、段 的重组蛋刍作为抗原,所建立的间接方法可以检测到所有血清型的.检测基因和外膜蛋白基因可以作为靶基因来检测。通过对基因的扩增产物分析来鉴定;但是用 基因来区分不同血清型并不理想,对株不同血清型和亚型的 基因序列进行/分,发现其相似度高达%曲丰发等,。胡清海等根据型株的基因序列建立了快速检测的方法胡清海等,:在对株的检测中,其检测下限为胡清海等,。的外膜蛋白基因同样可以用来检测,杨建远等通过比较株的外膜蛋白基因序列,选择其中保守区域设计引物,建立了特异性和敏感性均较好的方法,该方法对临床病料放入培养基中 增菌后,提取来进行扩增,可以很好的检测临床样本,同时与生化检测结果比较符合率达%杨建远,。.

29、间接血凝试验利用间接血凝试验检测血清中抗体,证明有一定的敏感性。高福、张鹤娟等利用鸭疫里氏杆菌热浸抗原致敏戊二醛化绵羊红细胞进行间接血凝试验,检测不同日龄的鸭血清中抗体,取得良好的效果高福等,;张鹤晓等,。.间接免疫酶组织化学法间接免疫酶组织化学法是一种敏感、特异,且可以定位抗原的方法,该方法最好的特点是可以对试验结果进行追溯。刘维平等建立了特异、直观的检测的间接免疫酶组织化学法,对自然感染和人工感染的鸭组织进行诊断效果较好刘维平等,。.预防与治疗对于养殖业,核心的思想为:养重于防,防重于治,养防并举,防治结合。因此,对于该病最好的应对措施应该是加强饲养管理,搞好环境卫生,加强消毒,严格掐断传

30、播途径。的可以通过呼吸道、消化道以及损伤的皮肤处等多种感染途径鸭感染鸭疫里氏杆菌肝脏基因差异表达研究感染鸭。但这些并不能做到万无一失,必须事先做好科学的免疫程序。一旦该病发生,及时使用敏感的药物也是有必要的。.药物防治和其他细菌一样,对许多磺胺类药物和抗生素敏感,但有些细菌质粒中可能含有某些耐药基因,因此,菌株的不同可能对其敏感的药物也不相同。药敏试验是检测敏感药物最常用的试验,有许多学者做过这类试验,并做过统计。早些年的结果中,大部分抗生素对于都很敏感。郭玉璞年所得结果为对土霉素或氯霉素敏感,在饲料中添加.%的药物. 即可见效。林琳等在年所得结果为对强力霉素、林可霉素、氟苯尼考和先锋高度敏感

31、。黄庆洲等在年所得结果为当地对甲砜霉素、氧氟沙星和先锋敏感。通过近年来的统计结果表明,尽管有些在做药敏试验是对氟苯尼考不敏感,但是在临床应用中,氟苯尼考使用的效果还比较令人满意,是控制该疾病的首选药物,例如刘小艳在年用%的氟苯尼考对病鸭进行肌肉注射,治愈率高达%。但随着其他细菌的耐药性的增强,动物用药也不断更新换代,强大压力下,越来越多的对上述药物开始不敏感。现在阿米卡星和第三代头孢逐渐成为控制细菌病的主流药物。黄淑坚等在,年所得试验结果为大部分对种药物较为敏感:孢唑啉、头孢拉定、阿米卡星氨苄西林和环丙沙星;氧氟沙星和庆大中度敏感;四环素和利福平不敏感。.疫苗防治由于的血清型繁多,多达种,且还

32、不断有新的血清型报道,而各型之间基本没有交叉保护性,因此事先了解当地流行株的血清型显得尤为重要。目前,的疫苗种类不算很多,有鸭疫里氏杆菌灭活菌苗、鸭疫里氏杆菌弱毒活菌苗、鸭疫里氏杆菌亚单位疫苗、鸭疫里氏杆菌和大肠杆菌二联苗,但主要还是使用灭活苗的居多,与大肠杆菌的二联苗也是较好的选择。弱毒苗有较好的免疫效果,并能持续作用很长时间,但存在毒力返强的危险,因此限制了其使用前景。的亚单位成分有外膜蛋刍和荚膜,许多学者针对这些蛋白研制了亚单位疫苗,并对其免疫效果进行了检测,表明亚单位疫苗能刺激机体产生有效的抗体,但目前生产中基本无应用。%,并且反转录获得的绝大部分仅为味端的,这部分通常为末端的非翻译区

33、,要获得翻译区还需要进行费时的文库筛选。等首先应用消减杂交技术克隆了染色体特异性探针。其基本原理是将比较基因表达差异的双方进行杂交,然后,从杂交混合物中分离出未杂交部分,但此方法需较大约腭,并且不能有效获得低丰度的转录物。以为基础的差减方法,主要为代表性差异分析法,为一种以为基础的消减杂交方法,一该方法首先将细胞中的经酶切后接上寡聚核苷酸接头,然后以其为引物进行扩增,得到小于 的驱动扩增子和待试扩增子,切除接头后,在片段端上接上新的接头后与过量的混合变性、复性并进行扩增,只有那些与有差别的 片段才能自身退火,并得到富集。此法虽为改良方法,但过程繁琐,而技术是此类方法中最新、最有效的一种。.抑制

34、行消减杂交技术的原理与方法消减杂交技术大体可以分为如下几步:组织总的提取;的提取:将所提取的反转录为并转,录为双链;双链酶切为小片段后制作 和为接头与经过酶切的片段相连后制成;两次消减杂交;两次扩增;鸭感染鸭疫里氏杆菌肝脏基因差异表达研究消减杂交技术基于如下几个原理:接头设计特点:.两个接头的序列见第二章表.两接头都是由一长链和一短链构成的,短链与长链的端构成平端的双链,且接头的端都无磷酸基团,而端有磷酸基团,这样保证只能为接头中的长链端与的一末端连接。.两个接头的端都有一段 相同的碱基,且序列与第一次扩增中的引物相同。共同引物既减少了引物二聚体的量,也在一定程度上起到了抑制的作用,因为小于的

35、片段容易形成发卡结构而得不到扩增,有利于较长片段的扩增。.两接头端的序列不同,分别与第二次扩增中所使用的两个引物相同:第二章表.和.接头上还含有酶的内切位点和启动子序列,接头上含有位点,且接头与连接处有/位点,接头上含有位点.产物可以被直接插入载体。这为以后的连接克隆载体和测序提供了基础。消减原理:根据杂交二级动力学原理,在退火时,丰度越高的单链与其互补的单链杂交的速度越快,从而使原来在丰度上不同的单链与其对应的互补链杂交后,他们的相对含量趋于一致。技术中,利用过量的驱赶子去消减测试子,丰度高的非差异表达基因杂交速度很快,迅速形成双链;而差异表达的基因丰度低,不易形成双链,从而使差异表达基因得

36、到富集。抑制原理:链内互补片段结合速度大于链间互补片段的结合速度。技术中,若杂交后的双链两端接头相同,两端补平后在单链的两端形成了较长的反向重复序列,退火时更易结合,形成“锅柄样”结构,使其无法与引物配对,从而抑制了非目的序列片段的扩增。具体过程如图.所示。华中农业大学届硕士研究生学位论文坩 睢撕假翻睢咖?盯一?一?二巴三,、.?日四母巴函鼬触奎/【?一。【一 【,?上加叫嘲. ?扩口蠢粕刚附鲫蠡,曩?啊,睁妇黼?医四.酥曲彻 .?口函:糍蕾 武 .图.抑制性差减杂交技术流程图. 鸭感染鸭疫里氏杆菌肝脏基因差异表达研究图所对应的具体步骤为:提取待测组与对照组的组织总后,纯化其中的,再反转录为双

37、链,经四碱基限制性内切酶消化为分子量为 左右的平端片段;选择其中一组作为测试子,另外一组则作为驱赶子,驱赶子不接接头,直接为消化好的片段,作测试子的片段分成两份,分别与两种不同的接头相连,即形成测试子;经过两次杂交:第一次杂交过程中,把过量的驱赶子分别加到接有不同接头的测试子中,热变性后退火,其间,测试子中与驱赶子中非差异表达基因的片段丰度较高,迅速杂交;差异表达基因片段丰度低, 得不到杂交,主要呈单链状态存在,从而被富集;第二次杂交过程中,将第一次杂交后的两液混合后再加过量的,只有差异表达的片段,形成新的型分子的可能性最大,通过补平两端后,只有型分子才能在下一步的中得到大量扩增;两步。在进行

38、前要迸行延伸反应来补平粘性末端,使引物退火时能与之相连。第一次所用引物为两接头中共同包含的引物,型和型分子只有一端能与引物相结合,所以只能呈线性增长,型分子中存在较长的反向重复序列,在变性退火的过程中很易形成“锅柄样结构,不能与引物相结合,也不能形成几何级增长。型分子也不能与引物结合,不能扩增。只有型分子,上下游都能与引物结合,且较长片段不能形成“锅柄样结构,因而能呈指数级增长。至此,差异表达的片段又一次得到了放大。第二次采用巢式,引物为和中的一段,此次是对差异表达基因的又一次富集,也为进一步试验/ /位点,奠定了基础。上有 位点和上有位点,可用于平端克隆,然后可用于定向克隆,而与接头的连接处

39、有利用杂交分析和测序等手段来分析差异表达的序列;利用这对引物克隆出片段可以直接插入载体。后来的探针筛选中的探针制作也会用到该产物:消减文库的扩增与鉴定;进一步对克隆出的片段进行分析鉴定;.抑制行消减杂交技术的优点自成功地建立以来,在生命科学领域得到了极大推广,如用于发现有关感染、应激、分化、细胞信号传导、肿瘤等相关基因的克隆与功能鉴定。较以往差异华中农业大学 届硕士研究生学位论文基因克隆方法有了重要改进,具有三者无法比拟的优点.,:高度的特异性。这主要来源于三个方面的设计特点:使用四碱基识别酶酶切,产生小于的片段,这样可防止片段形成复杂结构而影响杂交,同时使同一基因家族来源的片段不易自身交叉杂

40、交,大大提高了片段的代表性;应用两次消减杂交,将 片段均与过量 片段杂交,使差异表达基因的得到二次富集;充分应用了抑制性和巢式的原理,巧妙设计了两种不同的具有一段反向末端重复序列的寡聚核苷酸接头,这样不但使渺增过程中两端均为同一接头的非特异性分子自我形成发夹结构而被大大抑制,而且在两轮过程中依次分别使用与内外侧序列相吻合的引物,因此特异性扩增代表差异表达的片段。高灵敏性。技术有一个归一化过程,在第一次杂交过程中,由于杂交二级动力学的原因,高丰度的转录物易退火,这样高低丰度序列浓度趋于一致。试验证明,经过一轮消减杂交即可对稀少的片段的几个分子富集达倍,这样对低丰度的差异表达基因也能有效地克隆,这

41、也使技术成为大批量克隆新基因的有效方法,这是以往任何差异基因克隆方法远无法达到的。等用方法构建了小鼠胰腺转移性癌细胞系与非转移性胰腺癌细胞系差异表达的消减文库。任意取个克隆,在孔板中培养后,用扩增插入片段,扩增后产物经凝胶等量转入两块尼龙膜上,用的方法分别与和的忱进行杂交并放射自显影,放射自显影信号强弱代表着相应差异表达基因丰度的高低,信号越弱丰度越低。结果显示,在个阳性克隆中,高信号为例,中等强度信号为例,弱信号为例,而弱信号者中任选例进行 分析显示,除例为假阳性外,真阳性率达%。此个克隆经过序列分析发现,个属于已知基因,个与已知基因有.%不等的同源性。而个是完全未知的新基因,大部分克隆都被

42、挑到?次,这表明在消减文库无论高低丰度产物都有一定程度富集。据此估算,在两种细胞群中,表达丰度有很大差别的基因可以在筛选文库的最初个克隆得以分离,而丰度极低的差异表达基因则需要分析个克隆以上。相比于以往基因克隆的方法,技术对高低丰度的差异表达基因均能有效地克隆,因此它在一次杂交过程即可克隆出大量的差异表达基因,其中包括大量以往无法克隆的低丰度新基因。鸭感染鸭疫里氏杆菌肝脏基因差异表达研究、筛选的简便性。方法中二次产物可直接进行标记,成为、芯片技术、文库筛选等后期试验的优质特异性的探针,大大减少了探针制备、纯化的繁琐过程。此类探针可与经过反向消减文库将原作,原作进行消减杂交而获得的同类探针分别与

43、克隆进行杂交,可迅速鉴定出假阳性克隆。消减文库也可与未消减的进行杂交,可迅速鉴定出消减后特异性表达的基因。等比较了经野生型基因诱导的凋亡细胞系与未凋亡的细胞系,应用技术构建成功了凋亡信号传导过程中下游靶基因的消减文库,并且将文库中的克隆扩增后转入尼龙膜上,直接以的为探针进行杂交鉴定,结果不但获得,而且发现原癌基因 在消减文了已知的靶基因和库中得到大量富集,通过方法鉴定出基因在诱导的凋亡细胞系中的表达大大高于未凋亡的细胞系,这表明基因在细胞凋亡过程中受野生型蛋白的诱导而高表达,基因是基因介导的细胞凋亡信号通路中一个重要环节。华中农业大学 届硕士研究生学位论文第二章鸭感染鸭疫里氏杆菌肝脏差异基因的

44、筛选与鉴定研究的目的与意义鸭疫里氏杆菌病是由感染引起的雏鸭的一种急性、接触性败血性传染病,是当前严重危害全世界养鸭业的最主要的细菌性传染病。目前对的毒力因子及其致病机理还知之甚少,已完成的基因组测序工作将对致病机理的研究起到极大地促进作用。细菌性疾病的发生和转归是宿主与病原菌之间相互作用的复杂过程,雏鸭感染后表现为急性败血症,心脏、肝脏和脾脏等多种器官病理切片镜检为大量淋巴细胞浸润,表明宿主的免疫防御在宿主抗急性细菌感染过程中起到重要作用。然而,目前还没有关于鸭在急性细菌感染过程中基因差异表达的研究。抑制性消减杂交 ,技术已经成功应用于鉴定宿主在受到感染或免疫刺激后差异的表达基因,因此,在本研

45、究中利用技术研究鸭感染后肝脏差异表的基因,为进一步阐明的致病机理奠定基础。试验材料.主要仪器高速离心机:德国的;仪和实时荧光定量仪:均为美国的黜:电泳仪:瑞典的:凝胶成像系统:美国的 ;全自动蒸汽消毒灭菌器:中国台湾的;恒温摇床:美国的。.主要试剂、:购自疵。公司:提取试剂:购刍公司;.购刍公司:购自公司; :购刍公司;.:购刍公司:鸭感染鸭疫里氏杆菌肝脏基因差异表达研究:购 公司: 购自【公司: :购自公司;一:购公司;其它试剂为国产分析纯。.主要溶液的配制.抗生素类左右的灭菌中,并将终体积氨苄青霉素:氨苄青霉素溶解到,即终浓度为定容到 /,用. 的滤器过滤除菌,分装后保存在.。.细菌培养基

46、固体培养基:为公司的成品,按使用说明配制好后.下高压灭菌后备用。液体培养基:为公司的成品,按使用说明配制,高温灭菌。液体培养基:酵母浸出粉 ,胰蛋白胨 , ,溶解在,.高压灭菌左右的蒸馏水中,将值调为.后加水定容到分钟后备用。固体培养基:按.%的浓度加琼脂粉到上述方法配制的液体培养基后高压灭菌,倒入瓶皿冷却后备用。. .培养基:酵母浸出粉 , , ,胰蛋白胨.,.滤膜过滤除菌;再配制的,加去离子水溶解后定容至葡萄糖溶液 ,.岬滤膜过滤;加葡萄糖加去离子水溶解后定容到至上述培养基,混合均匀,保存。入除菌的葡萄糖液.质粒抽提相关溶液/,.溶液 /,葡萄糖. /,.蒸气灭菌 ,保存于备用。.%, .

47、溶液 /,现配现用。.溶液/,用冰醋酸调至.。华中农业大学 届硕士研究生学位论文碱用 溶解后,再力.缓冲液:,保存于室温备冰醋酸,最后用定容至.,. /和.用。缓冲液.%琼脂糖凝胶:缓冲液 加 稀释为后,加琼脂糖.,加热使其完全溶解。. .溶解,最后加/醋酸铵/溶液: 力约定容至 。/。/.的缓冲液:?., .酚:氯仿:异戊醇:向棕色瓶中加入适量.。再用吸管按酚:氯仿:异戊醇:的体积比分别送入到瓶底部,轻轻混匀。氯仿:异戊醇:向棕色瓶中加入适量.,再用吸管按氯仿:异戊醇:的体积比分别送入到瓶底部,轻轻混匀。.感染菌株与试验动物血清型鸭疫里氏杆菌云梦分离株由本实验室分离、鉴定和保存;日龄的无感染

48、的健康樱桃谷鸭购自武汉市郊某鸭场。.引物表.试剂盒提供的接头与引物璺坠宝兰:空璺鲤苎翌垒旦巴宝堕丛脱?. 记? 圮?巢式引物屺巢式引物鸭感染鸭疫里氏杆菌肝脏基因差异表达研究表 所需引物 基因引物产物 退火温度:, :. .?。 :.狐 个口 .,。 :,.:。盯 .。 :一 .¨一:. 研 :. 。:.:?.。:。也.:.广 .聊聊:.:珊珊:.:?广.:一 。一一:?.:.一一:下耋 :一:。豁;:盯。一一:.:?.:乙.协 ;:?:?一。札:?赋 :.尼巧 啪 :.:。. :。订:一一?。:。./乏嚣淼舞勰器。乏戮器跺愁勰需华中农业大学 届硕士研究生学位论文试验方法.试验鸭人工感

49、染与病料的采集准备好含%的新生牛血清的培养基平板。将.冻干保存的株划线接种于,置于浓度为%的恒温培养箱,培养 后,取单菌落接种于液体培养基,培养 后,按%比例接种于液体培养基,于,/振荡培养,当培养基的值达到.时,将菌液离心 弃上清,用.%的生理盐水悬浮,洗菌两次,用比浊法将菌/.。液浓度调为。只日龄樱桃肉谷鸭饲养至日龄分为两组,每组只并编号,感染组肉/只,在感染后鸭脚蹼接种菌液. ,取出发病症状明显或濒死肉鸭的肝脏,迅速放入液氮中保存,同时取样进行细菌分离鉴定;对照组脚蹼接种无菌生理盐水./只。.组织总的提取用试剂提取感染组和对照组的鸭肝脏组织总,取出保存在液氮中的鸭肝脏组织,按 提取试剂的操作说明进行提取:从液氮中取出采集好的鸭肝脏,迅速称取,放入事先高温过夜并预冷的研钵中,加入液氮后快速研磨,使其成为匀浆,并破碎组织,室温下加入 溶液后混匀并放置 ,使其进行充分的孵育;的量事先用水处理 离心管后灭菌,将上述混合物按每管分装在离心管中并加入 氯仿,合盒盖后剧烈振荡,大约 后室温