色谱分析法概论

1、贾沪宁贾沪宁分析化学教研室分析化学教研室B色谱+红外（11,12,13,14,6）11. 色谱分析法概论1. 概述概述2. 色谱过程和术语色谱过程和术语 3. 色谱分离的基本理论色谱分离的基本理论4. 色谱法的发展趋势色谱法的发展趋势 5. 小小 结结M.Tsweet固定相：碳酸钙固定相：碳酸钙 ；流动相：石油醚；流动相：石油醚色谱法起源1. 1 概述概述 利用各组分物理化学性质的不同，在流动相流经固定相时，由于各组分在两相间的吸附、分配或其它亲和力的差异而产生不同速度的移动，最终达到分离的目的。chroma （色（色 ）graphy（图）（图）色谱法定义色谱法定义分离基础分离基础差 速 迁

2、移色谱法发展柱色谱柱色谱薄层色谱法（薄层色谱法（TLC），纸色谱法（），纸色谱法（PC）气相色谱法（气相色谱法（GC）气质联用技术（气质联用技术（GC-MS）高效液相色谱（高效液相色谱（HPLC）超临界流体色谱超临界流体色谱 (SFC) 毛细管电泳（毛细管电泳（CE）色谱法特点 分离功能为主；定性鉴别专属性好，定量分析准确灵敏快速。 可分离组分性质相似混合物可分离分析存在干扰组分的复杂体系2.1色谱过程色谱过程u 物质分子在相对运动的两相间，u分配“平衡”的过程。u 分离机制是差速迁移。例：顺反偶氮苯在柱中吸附解吸附，再吸附NNNN反顺2.2.色谱法的基础知识色谱法的基础知识图图11-12.2

3、基本术语基本术语2.2.1色谱流出曲线(3) 标准差（）：两拐点间距离之半。(4) 峰宽（peak width， W 或Y）：通过色谱峰两侧的拐点作切线，在基线上的截距。如图 IJ 间的距离。峰宽W = 4，W1/2 = 2.355W = 1.699 W1/2(5) 半峰宽（peak width at half height， W1/2 或Y1/2 ）：峰高一半处的峰宽，如图GH间的距离。 tR 是色谱的定性参数，同组分相同色谱条件下，tR 应相同。(1) 保留时间（retention time， tR )： 从进样开始到某个组分的色谱峰顶点的时间间隔。2.2.2保留值(1) 死时间（dead

4、 time, t0)： 不被固定相滞留的组分(流动相)从进样开始、通过色谱柱，到出现最大值所需要的时间。(3) 调整保留时间（adjusted retention time， tR ) 组分由于和固定相作用，比不作用的组分在柱中多停留 的时间。(4) 保留体积（retention volume， VR )： 组分从进样到出现峰最大值所需要的流动相体积。 RRcVt F载气流速 恒定值 与载气流速无关 (5) 死体积（dead volume， V0 ) 由进样器至检测器的流路中未被固定相占有的空间体积。00cVt F注意：死体积大，色谱峰扩张，柱效降低。 VR与流动相流速无关 VR和 tR同属于

5、色谱定性参数0RRRcVVVtF即： VR是定值， tR与Fc成反比注： VR与Fc无关(6) 调整保留体积（adjusted retention volume， VR ) 其本质为组分停留在固定相时所消耗流动相的体积。V0 和和 Vm、t0 和和 tm 的区别：的区别： 由进样器至检测器的流路中未被固定相占有的空间体积称为V0 ，固定相充满死体积所需的时间为t0 。 平衡时流动相在色谱柱中占有的体积用Vm表示，经过色谱柱所需时间用tm 表示。物理意义有区别： Vm V0，tm t0 。 在多数情况下，可忽略导管和检测器内腔容积，视为近似相等。(1) 分配系数(partition coeffi

6、cient，K )u 平衡时，组分在固定相与流动相中的浓度比u 与温度有关2.2.3 分配系数和保留因子smcKc2.2.4 相平衡常数相平衡常数吸附系数adsorption coefficientKaKKs KpK分配系数partition coefficient渗透系数permeation coefficient选择系数selectivity coefficient(2) 保留因子（retention factor，k )u平衡状态下，组分在固定相与流动相中的质量之比sssmmmcVVkKc VVu k 与组分、固定相和流动相的性质及温度、压力等有关 k不同 tR不同 分离 u k 与 t

7、R 关系0(1)Rttks0m(1)RVttKV2.2.5 分离参数分离参数(1) 分离因子 （分配系数比、选择性系数）2211RR2211RRtVKkKktV(2) 分离度（resolution， Rs )2121RRRR21212()2( )sttttRWWWW分离度（resolution， Rs )R = 1.0 基本分离R = 1.5 完全分离完全分离例：某色谱柱的Vs=1.3 mL、V0=2.1 mL，分离A、B 两物质 KA=10.0、KB=40.0。试计算A、B的保留体积。 解：设V0=Vm，则VR=V0(1+KVs/Vm) 可得：VR(A)=15.1 mL VR(B) =54.

8、1 mL 例：一个气相色谱柱，由固定液的涂量及固定液在柱温下的密度计算得Vs=14.1mL ，载气流速为43.75mL/min。分离一个含A、B、C三组分的样品，测得组分保留时间组分A为1.41min、组分B为2.67min、组分C为4.18min、空气为 0.24min。 试计算： (1) 死体积（假定检测器及柱接头等体积可忽略） (2) 各组分的调整保留时间和分配系数 (3) 相邻组分的分配系数比解： 00c0.24 43.7510.5(mL)Vt FABCRR0RR1.41 0.241.17(min)2.43(min)3.94(min)tttttsmRmms0scVtVKkcVtVARm

9、A0s1.1710.53.630.2414.1tVKtV所以： B7.54K 12.2CK相邻峰分配系数比为： 7.542.083.63BABAKK12.21.627.54CBCBKK2.3 色谱法分类色谱法分类 两相所处的状态分 离 机 理操 作 类 型两相所处的状态流动相固定相类型液相色谱液固L-S 色谱液液L-L 色谱气相色谱气固G-S 色谱气液G-L 色谱操作类型操作类型柱色谱( column chromatography ): HPLC， GC etc.平板色谱 ( planar chromatography ): TLC， PC分离机理分离机理 分离机理 不同 吸附色谱法 （ads

10、orption chromatography） 分配色谱法 （partition chromatography） 离子交换色谱法 （ion exchange chromatography ） 空间排阻色谱法 （又称分子排阻色谱法） （size exclusion chromatography）2.4 色谱基本类型的分离原理色谱基本类型的分离原理1. 吸附色谱法吸附色谱法X:溶质分子Y:流动相分子a:吸附剂 m:流动相XaYmYa 吸附色谱法（adsorption chromatography)吸附能力：用吸附平衡常数（吸附系数）吸附能力：用吸附平衡常数（吸附系数）K衡量。衡量。 极性强，极性强

11、，K值大，易吸附，有较大保留值。值大，易吸附，有较大保留值。 主要包括主要包括柱色谱柱色谱和和平面色谱平面色谱 吸附剂：吸附剂：硅胶、氧化铝；硅胶、氧化铝； 流动相：流动相：不同的有机溶剂（或气体）不同的有机溶剂（或气体） 溶质的保留和分离：溶质和流动相溶质的保留和分离：溶质和流动相对吸附剂表对吸附剂表面活性中心的竞争面活性中心的竞争2.分配色谱 利用被分离组份在固定相或流动相的利用被分离组份在固定相或流动相的溶解度差溶解度差别别而实现分离而实现分离 固定相：固定相：固定液固定液；流动相：；流动相：气体或液体气体或液体早期通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定相，现多为化学键合固定相，即用化学反

12、应的方法通过化学键将固定液结合在担体表面。 分配色谱示意图 流动相(m)中的溶质分子 溶解在固定液(s)中的分子smcKcsR0m(1)VttKV 正相色谱与反相色谱正相色谱与反相色谱: 正相正相 反相反相 固定相极性固定相极性 大大 小小 流动相极性流动相极性 小小 大大 流出顺序流出顺序 极性小的组分先极性小的组分先 极性大的组分先极性大的组分先 3 离子交换色谱 固定相为离子交换树脂，流动相为无机酸或无机碱的水溶液。各种离子根据它们与树脂上的交换基团的交换能力的不同而得到分离。固定相：离子交换树脂固定相：离子交换树脂流动相：水溶液流动相：水溶液 分离机制：不同亲和力，差速迁移分离机制：不

13、同亲和力，差速迁移分离对象：分离对象：离子型离子型化合物化合物 离子交换树脂离子交换树脂 具有网状结构的高分子聚合具有网状结构的高分子聚合物物CH CH2CH CH2CH CH2单体+聚合骨架联上酸性基团：阳离子交换树脂（联上酸性基团：阳离子交换树脂（-SO3H , -COOH等等 ） 联上碱性基团：阴离子交换树脂（联上碱性基团：阴离子交换树脂（-NH2 , -NHR等）等）阳离子阳离子交换反应：交换反应：（树脂可反复使用，用（树脂可反复使用，用HClHCl浸泡，冲洗浸泡，冲洗) )阴离子阴离子交换反应：交换反应： ( ( 阴离子树脂的再生阴离子树脂的再生, ,用适当的碱液浸泡用适当的碱液浸泡

14、) ) nRSO3H + Mn+变换洗脱(RSO3)nM +nH+用NaOH滴定H+，由耗V求X%(树脂再生)N(CH3)3+OH -R+ Cl -变换洗脱N(CH3)3+Cl -R+ OH -用酸液滴定可求X%H+应用应用：1 1 除去干扰离子，如制备去离子水；除去干扰离子，如制备去离子水； 2 2 盐类的测定盐类的测定 如乳酸钠的测定。如乳酸钠的测定。4 空间排阻色谱（凝胶色谱） 以凝胶为固定相。凝胶是一种经过交联的、具有立体网状结构和不同孔径的多聚体的统称。如葡聚糖凝胶、琼脂糖等软质凝胶；多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶。 凝胶色谱示意图Ge - 凝胶 m - 流动相 固定相：凝胶固定相

15、：凝胶 流动相：水流动相：水 分离对象：较大分子尺寸的高聚物、蛋白质、分离对象：较大分子尺寸的高聚物、蛋白质、 多糖等多糖等 分离机制：按分子大小分离分离机制：按分子大小分离 大分子先流大分子先流出出sR00m(1)(1)VttktKV 结论： 在色谱柱 (或板) 一定时，Vs与Vm一定；若流速、温度也一定，t0一定， tR仅取决于分配系数K，K大的组分tR长。 在实验条件一定时，tR取决于组分性质定性指标。色谱过程方程：3.1 分配系数与保留行为的关系分配系数与保留行为的关系3. 色谱分离的基本理论色谱分离的基本理论3.2 等温线等温线 在一定条件下，组分在固定相和流动相间分配达到平衡时，在

16、两相中的浓度cs和cm的比值K为常数，由此绘制出的cs和cm的关系曲线显然应为一条直线，被称为等温线。 等温线对各种类型的色谱有指导意义等温线对各种类型的色谱有指导意义 线性等温线线性等温线 a（理想）（理想） 对称峰对称峰 非线性等温线非线性等温线 凸形凸形 b 拖尾峰拖尾峰 凹形凹形 c 前沿峰前沿峰色谱峰的对称性：色谱峰的对称性： 一般使用对称性因子一般使用对称性因子(symmetry factor) ，计算式为：计算式为：ABAAWTh2205.0完全对称 (B=A) 峰的对称因子为1.00 。对称因子为0.951.05之间的峰看成为正常峰 (对称); BA: T大于1.05的为拖尾峰

17、。 中国药典中国药典20052005年版年版: : 拖尾因子拖尾因子105.02 dWTh 3.3 塔板理论塔板理论 最早由最早由Martin等人提出，把色谱柱比作一个精馏塔等人提出，把色谱柱比作一个精馏塔 沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为 引入理论塔板数引入理论塔板数 ( n ) 作为衡量柱效率的指标作为衡量柱效率的指标(1)色谱柱由若干连续、等距的水平塔板组成，每层塔板的高度用H表示， 样品和流动相同时加在第 1个塔板上(2)分配瞬间达平衡, 分配系数在各塔板上是常数， 忽略样品沿柱方向的纵向扩散(3) 载气非连续而是间歇

18、式进入色谱柱，每次进气一个塔板体积；3.3.1 塔板理论的几个基本假设 ( 把色谱柱看作一个分馏塔)3.3.2 理论塔板高度和塔板理论数 (1) 理论塔板数 n 组分流过色谱柱时，在两相间进行平衡分配的总次数 (2) 理论塔板高度 H 为使组分在柱内两相间达到一次分配平衡所需要的柱长LnH2221/2()16()5.54()RRRtttnWW结论结论：色谱峰 W 越小，n 就越大，而 H 就越小，柱效越高 n 和 H 是描述柱效的指标 n 的影响因素：的影响因素：u柱本身的性质；u 溶剂系统；u 测定组分 讨论：nL，n1/H (1) L 一定，n，柱效，分离能力 (2) 一定，n，但柱压和分

19、析时间2221/2()16()5.54()RRRtttnWWLnH22RR1 216()5.54()ttnWW有效有效/nLH有效(3) 有效理论塔板数、有效理论塔板高度 由于死时间 t0 包括在 tR 中，而实际的 t0 不参与柱内分配，所计算的 n 值大，H小，但与实际柱效能不同；因此常把 t0 扣除，采用有效理论塔板数 n有效 和有效塔板高 H有效评价柱效。 例11-2：已知气相色谱柱长2.0m，固定相为80100目白色硅藻土 上涂渍的5%OV-17，柱温125， 载气(N2)流速30mL/min， 记录纸速为2.0cm/min。 测得萘的保留时间为2.35min，半峰宽为0.20cm。

20、求理论塔板数和板高。若用甲烷测得死时间为0.20min， 求有效理论塔板数和板高。)(65.03100200031000.2/20.035.254.52mmHn)(77.02600200026000 .2/20.015.254.52mmHn有效有效解：扣除死时间的影响，用tR代替tR计算n有效和 H有效， tR=2.35-0.20=2.15 (min)3.3.3 塔板理论的特点 当色谱柱长度一定时，塔板数当色谱柱长度一定时，塔板数 n 越大越大 (塔板高度塔板高度 H 越越小小)，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。高，所得

21、色谱峰越窄。 不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。测定物质。3.3.4 塔板理论的局限性 柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数当两组分的分配系数K相同时，无论该色谱相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。柱的塔板数多大，都无法分离。 塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的实验结果，也无法指出影流速下柱效不同的实验结果，

22、也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。响柱效的因素及提高柱效的途径。van Deemter 方程式塔板理论塔板理论优缺点优缺点1.4.3 速率理论速率理论3.4 速率理论速率理论 1956 年荷兰学者 van Deemter 等在研究气液色谱时提出 色谱过程动力学理论 应用了塔板理论板高 H 的概念 充分考虑了组分在两相间的扩散和传质过程 从动力学角度较好地解释了影响柱效的因素van Deemter 方程的数学简化式为：B / u纵向扩散项纵向扩散项A涡流扩散项涡流扩散项H式式中中 u 为为流流动动相相的的线线速速度：度： A，B，C 为为常常数数A涡涡流流扩扩散散系系数；数； B纵纵向向

23、扩扩散散系系数；数； C传传质质阻阻抗抗系系数数uCuBAH/Cu传质阻抗项传质阻抗项3.4.1 涡流扩散项（多径扩散项）：A (2) 涡流扩散系数 pdA2填料粒径填料粒径 填充不规则因子填充不规则因子涡流扩散动画 载气携样品进柱，遇到来自固定相颗粒的阻力 路径不同涡流扩散 (1) 产生原因(3) 影响因素： 固定相颗粒越小，填充越均匀，A 项越小 填充柱 （25mm） 空心毛细管柱（0.1 0.5 mm），A=0，较高 n 讨论： pdAHn，柱效pdAHn，柱效pdA23.3.2 纵向扩散项（分子扩散项）：B/u 产生原因： 组分在固定相中被流动相推动向前、展开 浓度梯度 谱带展宽分子扩

24、散动画B/u 纵向扩散项： 由于流动相的扩散，溶质沿着柱长方向，存在着浓度差，产生纵向扩散， 又称分子扩散相，导致色谱峰变宽，H (n)，分离变差。 B = 2Dg ：弯曲因子，填充柱色谱， 1 Dg：试样组分分子在气相中的扩散系数（cm2s-1） 讨论： 与填充物有关的因子（ 扩散阻碍因子 ） 空心柱 =1; 填充柱 1 纵向扩散与 u 成反比 u 大，B /u 可忽略; u 小，不可忽略 Dg 组分在气相中的扩散系数 M载气 大，Dg 小，如：N2 M载气 小，Dg 大，如：H2 ，HeB = 2 Dg影响因素： MTDTDgg或分子扩散项与流速有关，流速，滞留时间，扩散 扩散系数：Dg

25、和（M载气）1/2 成反比讨论： RgutTMD （）或/B uHn，柱效高流速/低柱温/大 M载气2fgll2l23 (1)dkCCCCkD3.4.3 传质阻抗项(Cu)(2) 传质阻抗系数：fd -固定液液膜厚度Dl 组分在固定液中扩散系数传质阻抗动画(1) 产生原因：样品在气液两相间分配，样品未及溶解就被带走;或未能及时解析，从而造成峰扩张 注意：固定液应完全覆盖载体表面，不可以太薄，否则k太小，柱子寿命也短。(3) 影响因素：fldTD柱效，nHuCCl2flldCDlTDl2(1)kCkH u 曲线与最佳流速：曲线与最佳流速： 流速对 B、C 两项相反的作用，对柱效的总影响使得存在着

26、最佳流速值。 以塔板高度 H 对应载气流速 u 作图，曲线最低点的流速即为最佳流速。柱效与流速柱效与流速（1）柱效与流速）柱效与流速u u最佳，C项可忽略，H=A+B/u;u u最佳，B项可忽略，H=A+Cu柱效与色谱条件的关系柱效与色谱条件的关系uCuBAH/20dHBCuB Cduu 最佳M(/ )2Lucm sHABCt最小最佳流速最佳流速综合优化综合优化u最佳；足够大Rs; 较短 tRu一定，三个常数，H，n，峰形越窄（2）填料粒径）填料粒径 细粒径，高柱效；高柱压（3）柱温）柱温 升高柱温，扩散系数升高；柱效降低；改善传质，柱效升高u 被分离组分分子在色谱柱内运行的多路径、浓度梯度所造成的分子扩散及传质阻力使气液两相间的分配平衡不能瞬间达到等因素是造成色谱峰扩展柱效下降的主要原因。u 通过