细菌病毒培养技术

1、细菌培养技术细菌培养技术 1 细菌的培养基本知识细菌的培养基本知识2 细菌的规模化培养细菌的规模化培养3 细菌的计数技术细菌的计数技术对氧气要求：专性需氧菌 微需氧菌 兼性厌氧菌 专性厌氧菌对CO2要求： 5% CO2水碳源氮源无机盐生长因子 有些细菌需要（一）（一） 细菌生长繁殖的条件细菌生长繁殖的条件4、对气体要求、对气体要求 4、PH1、营养物质、营养物质2、温度、温度3 3、渗透压、渗透压（二）细菌生长繁殖的方式（二）细菌生长繁殖的方式二分裂法二分裂法繁殖方式：繁殖方式：链球菌链球菌八叠球菌八叠球菌葡萄球菌葡萄球菌（三）细菌生长繁殖的速度（四）细菌生长繁殖的速度（四）细菌生长繁殖的速度

2、 分为四期：迟缓期 、 对数期、稳定期、衰退期（五）常用培养基种类（五）常用培养基种类厌氧培养基厌氧培养基基础培养基基础培养基增菌培养基增菌培养基选择培养基选择培养基鉴别培养基鉴别培养基细菌培养技术 1 细菌的培养基本知识细菌的培养基本知识2 细菌的规模化培养细菌的规模化培养3 细菌的计数技术细菌的计数技术二、细菌的规模化培养二、细菌的规模化培养种子接种种子接种 是指菌体增殖培养物。是指菌体增殖培养物。收获时间收获时间 最佳培养时间依据细菌的生长曲线而定。最佳培养时间依据细菌的生长曲线而定。培养方法l1固体培养基表面培养法固体培养基表面培养法 用于制备抗原、灭活苗、冻干苗。用于制备抗原、灭活苗

3、、冻干苗。l2液体静置培养法液体静置培养法 需氧菌（深度需氧菌（深度1/2）和兼性厌氧均可用，厌氧菌（深度）和兼性厌氧均可用，厌氧菌（深度3/4），还需加肝块。），还需加肝块。l3深层通气培养法深层通气培养法 是目前菌苗生产的主要培养法。安装有自动控温、消泡、是目前菌苗生产的主要培养法。安装有自动控温、消泡、调调pH、自动控制通气量、自动磁力搅拌等装置。细菌接、自动控制通气量、自动磁力搅拌等装置。细菌接种种12h，再通入滤过除菌空气，并适当搅拌分散通入，再通入滤过除菌空气，并适当搅拌分散通入的气体，以增加培养液中的溶氧量。及时补充营养的气体，以增加培养液中的溶氧量。及时补充营养 。l4透析培养

4、法透析培养法在细菌培养液与培养基之间隔有一层透析在细菌培养液与培养基之间隔有一层透析膜，使培养基中高浓度小分子量的营养成膜，使培养基中高浓度小分子量的营养成分通过透析膜（不能透过大分子的细菌或分通过透析膜（不能透过大分子的细菌或毒素）不断扩散到细菌培养液中，供细菌毒素）不断扩散到细菌培养液中，供细菌生长繁殖，获得高浓度的细菌或毒素。生长繁殖，获得高浓度的细菌或毒素。 5、连续培养、连续培养 连续培养系统是一个恒定体积的流动系统，新鲜培养基以恒定的速度流入，又以相同的速率流出除去多余的液体，细菌始终保持在对数生长期。细菌培养技术 1 细菌的培养基本知识细菌的培养基本知识2 细菌的规模化培养细菌的

5、规模化培养3 细菌的计数技术细菌的计数技术三三 细菌的计数技术细菌的计数技术l细菌性疫苗在制造中，往往需要计算每毫升所含细细菌性疫苗在制造中，往往需要计算每毫升所含细菌的总数。菌的总数。l 1.显微镜直接计数法显微镜直接计数法l2.活菌计数法活菌计数法倾注平板培养法倾注平板培养法 将被测样品根据菌数含量多少，用普通肉汤或生理盐水作10倍递进稀释。分别取其1ml加在灭菌的平皿中，然后取预先加热融化且冷至4550，立即摇匀放平，凝固后培养，统计平皿上长出的菌落数，乘以稀释倍数，即为每毫升样品中含有的活菌数。平板表面散布法平板表面散布法 接种量为0.1ml 琼脂板的制备 稀释菌液 接种 培养 计数

6、选择菌落数在30300之间的平皿用以计数，每个稀释度应取其菌落平均数。 l活菌数ml=2个平板平均菌落数10稀释倍数。l举例：在10 稀释的平板中所得平均菌落数为78个。l计算结果：781010 =7.810 个活菌ml微量点板计数法微量点板计数法 接种量为0.02ml10-8-8l 3 比浊计数法比浊计数法 l是对比细菌悬液与标准管的浊度，求出大致的菌数。l原理：菌液中含数多少与其浑浊度成正比。l方法：比浊管比浊法和分光光度计法。l优点：快速简便l应用：常用于菌苗及其他生物制剂的生产、细菌毒力的测定和攻毒量的确定等。标准比浊法标准比浊法l比浊管比浊管 由国家生物制品检定部门提供，每套包括一支

7、细菌比浊标准管、数支对照空管和一张比浊用的图片。l比浊方法比浊方法 将空管拭刷干净，加入待测菌液1ml。将标准管与待测管并列紧贴在图片前，使两管受光均匀，然后透过两管管壁对比观察，目测图片的清晰度，并将两管左右换位，反复对比。 l例如：测定大肠杆菌的菌数，若1ml菌液加入4ml的生理盐水后，与标准管的浊度相同，即表示该菌液经5倍稀释后相当于标准管。大肠杆菌标准管的菌数相当于8亿个ml，故被测菌数为85=40亿个ml。分光光度计法分光光度计法l借助于分光光度计借助于分光光度计。在一定波长下测定菌液的光密度值l注意注意 ：测量时一定要控制菌浓度与光密度成正比的线性范围内，否则不准确。病毒培养技术

8、l1 1 病毒的复制病毒的复制l2 2 病毒的动物培养技术病毒的动物培养技术l3 3 病毒的禽胚培养技术病毒的禽胚培养技术l4 4 病毒的细胞培养技术病毒的细胞培养技术病毒复制：以病毒基因为模板，在酶的作用下，分别合成基因和蛋白病毒复制：以病毒基因为模板，在酶的作用下，分别合成基因和蛋白质，再组装成完整的蛋白颗粒，这种方式称为复制（质，再组装成完整的蛋白颗粒，这种方式称为复制（ replication) 。吸附吸附侵入侵入早期：病毒特异性酶的合成早期：病毒特异性酶的合成病毒核酸复制病毒核酸复制病毒结构蛋白质合成病毒结构蛋白质合成装配装配释放释放病毒大分病毒大分子合成子合成病毒培养技术 l1 1

9、 病毒的复制病毒的复制l2 2 病毒的动物培养技术病毒的动物培养技术l3 3 病毒的禽胚培养技术病毒的禽胚培养技术l4 4 病毒的细胞培养技术病毒的细胞培养技术1 病毒的动物培养技术动物的选择动物的选择 应当选择应当选择SPF动物。选择动物的条件下：动物。选择动物的条件下： 选用对病毒易感性高。选用对病毒易感性高。 动物健康、体重、年龄尽可能一致，符合培养病毒要求。动物健康、体重、年龄尽可能一致，符合培养病毒要求。 遗传特性相似，实验结果具有一致性、准确性和可比性。遗传特性相似，实验结果具有一致性、准确性和可比性。 外购动物要了解当地动物群健康，饲养及免疫接种情况，外购动物要了解当地动物群健康

10、，饲养及免疫接种情况，接前要经过健康观察，以免误用带有病原体动物。接前要经过健康观察，以免误用带有病原体动物。l1.皮内接种皮内接种l2.皮下接种皮下接种l3.肌肉接种肌肉接种l4.静脉接种静脉接种l5.腹腔接种腹腔接种动物接种途径和方法动物接种途径和方法 动物接种后的饲养管理与收获病毒l 1.1.接种病毒后的动物接种病毒后的动物, ,每天观察和检查规定的每天观察和检查规定的各项指标，主要有精神、食欲、粪便、尿液、被毛各项指标，主要有精神、食欲、粪便、尿液、被毛状态、活动情况和接种部位的局部反应，每天测体状态、活动情况和接种部位的局部反应，每天测体温温1 1次，做好记录。次，做好记录。l 2.

11、2.出现反应症候动物，按规定方法剖杀，采出现反应症候动物，按规定方法剖杀，采取含病毒高的组织脏器。取含病毒高的组织脏器。 病毒培养技术 l1 1 病毒的复制病毒的复制l2 2 病毒的动物培养技术病毒的动物培养技术l3 3 病毒的禽胚培养技术病毒的禽胚培养技术l4 4 病毒的细胞培养技术病毒的细胞培养技术2 病毒的禽胚培养技术工序过程：工序过程：如何完成此如何完成此项任务？项任务？选择禽胚选择禽胚前孵育前孵育接种接种后孵育后孵育收获病毒收获病毒操作要点1 1 禽胚的选择禽胚的选择 理想的禽胚是理想的禽胚是SPF鸡胚，常以非免疫鸡胚补充。鸡胚，常以非免疫鸡胚补充。l2 禽胚的接种前禽胚的接种前孵育

12、孵育 孵化前消毒，温度孵化前消毒，温度37.538.5，相对湿度，相对湿度50%60%，定时翻蛋，保证通风。孵化定时翻蛋，保证通风。孵化45d照蛋检查，淘汰无精蛋照蛋检查，淘汰无精蛋和死胚，孵化至所培养病毒需要的日龄即可接种。和死胚，孵化至所培养病毒需要的日龄即可接种。 3 禽胚的接种途径痘病毒和疱疹病痘病毒和疱疹病毒，毒，1013日龄日龄 流感、新城疫、传流感、新城疫、传支等，支等，911日龄日龄 鹦鹉热衣原体和立克鹦鹉热衣原体和立克次氏体等，次氏体等，68日龄日龄正粘病毒和副粘病正粘病毒和副粘病毒，毒，1011日龄日龄4 禽胚的接种后孵育 接种后，蜡泪封孔，置接种后，蜡泪封孔，置3737下

13、孵化下孵化 ，每天照蛋每天照蛋2 2次以上，通过禽胚的病变初步确次以上，通过禽胚的病变初步确定病毒的存在及增殖情况，淘汰定病毒的存在及增殖情况，淘汰24h24h内死胚。内死胚。 操作要点病毒感染指征：病毒感染指征：死亡死亡充血、出血或出现坏死灶充血、出血或出现坏死灶畸形畸形出现痘斑出现痘斑l5 5 病毒的收获病毒的收获 操作要点 绒毛尿囊膜接种绒毛尿囊膜接种 尿囊膜接种尿囊膜接种卵黄囊接种卵黄囊接种羊膜腔接种羊膜腔接种照照 蛋蛋尿囊腔接种法尿囊腔接种法接种部位消毒接种部位消毒尿囊腔接种尿囊腔接种收获尿囊液收获尿囊液每枚鸡胚收获尿囊液每枚鸡胚收获尿囊液68ml病毒培养技术 l1 1 病毒的复制病

14、毒的复制l2 2 病毒的动物培养技术病毒的动物培养技术l3 3 病毒的禽胚培养技术病毒的禽胚培养技术l4 4 病毒的细胞培养技术病毒的细胞培养技术细胞培养技术（cell culture)l 细胞培养技术是选用各种细胞的最佳生存条细胞培养技术是选用各种细胞的最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术。件对活细胞进行培养和研究的技术。l即：利用机械、酶或化学方法使活体动物组即：利用机械、酶或化学方法使活体动物组织或传代细胞分散成单个乃至织或传代细胞分散成单个乃至24个细胞团个细胞团悬液的培养，悬液的培养，使之能继续生存、生长、增殖使之能继续生存、生长、增殖的一种方法。的一种方法。l广义上广义上: :

15、还包括组织培养、器官培养还包括组织培养、器官培养。3 病毒的细胞培养技术u细胞培养的方式细胞培养的方式l 原代培养：原代培养：从直接取自生物体细胞、组织或从直接取自生物体细胞、组织或器官开始的培养。器官开始的培养。l 次代培养：次代培养：将原代细胞培养物轻微消化后，将原代细胞培养物轻微消化后，再洗下分装至含新鲜培养液的培养管中继续培再洗下分装至含新鲜培养液的培养管中继续培养。养。 l 传代培养：传代培养：将培养细胞以一个培养瓶转移或将培养细胞以一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶中进行培养。移植到另一个培养瓶中进行培养。 培养常用的细胞l上皮细胞、成纤维细胞上皮细胞、成纤维细胞根据培养细胞的染色

16、体和繁殖特性，可分为：根据培养细胞的染色体和繁殖特性，可分为：l 原代细胞原代细胞 直接利用新鲜动物组织经胰蛋白酶消化、分散，获直接利用新鲜动物组织经胰蛋白酶消化、分散，获得单个细胞，如鸡胚成纤维细胞，此细胞对病毒的检测最为敏感，得单个细胞，如鸡胚成纤维细胞，此细胞对病毒的检测最为敏感，但制备和应用不方便。但制备和应用不方便。l 二倍体细胞（细胞株）二倍体细胞（细胞株） 由原代细胞或次代细胞选育出具有特殊由原代细胞或次代细胞选育出具有特殊生物学性质和标记的细胞，如猪肾细胞株（生物学性质和标记的细胞，如猪肾细胞株（PK-15）和乳仓鼠肾细）和乳仓鼠肾细胞株（胞株（BHK-21）等。适用于病毒性生

17、物制品的制备，常用于疫苗）等。适用于病毒性生物制品的制备，常用于疫苗生产，安全可靠。生产，安全可靠。l 传代细胞（非二倍体细胞系、异倍体细胞）传代细胞（非二倍体细胞系、异倍体细胞） 指不再保持原来细指不再保持原来细胞的二倍体细胞数，在体外可以无限传代的细胞，如人子宫癌细胞的二倍体细胞数，在体外可以无限传代的细胞，如人子宫癌细胞（胞（HeLa细胞）和鼠肾腺癌细胞（细胞）和鼠肾腺癌细胞（RAG细胞）等。有致癌性，不细胞）等。有致癌性，不能用于疫苗生产，多用于病毒的分离鉴定。能用于疫苗生产，多用于病毒的分离鉴定。 1.培养液培养液：生长液、维持液，：生长液、维持液，Eagle氏液、氏液、RPMI-1

18、640、199、DMEM、MEM等营养液等营养液 。 2.细胞接种量细胞接种量:适宜。适宜。3.pH：一般为：一般为7.07.4因细胞种类不同而略有差异。因细胞种类不同而略有差异。 4.温度温度：一般为：一般为3738。 5.气体气体：氧气和二氧化碳。：氧气和二氧化碳。 6.无菌条件无菌条件：培养的全过程都要求严格的无菌条件：培养的全过程都要求严格的无菌条件 。u细胞培养的基本条件细胞培养的基本条件各种组织是靠细胞间质黏合而成的，要获得分散的细胞，各种组织是靠细胞间质黏合而成的，要获得分散的细胞，必须破坏细胞间质。分散细胞的方法的三种：必须破坏细胞间质。分散细胞的方法的三种：l机械分散法机械分

19、散法：适用于细胞间连接较松的组织，如禽胚：适用于细胞间连接较松的组织，如禽胚组织。组织。 l酶消化法酶消化法：此法适用于原代细胞的制备及细胞的传代：此法适用于原代细胞的制备及细胞的传代培养。培养。l螯合剂分散法螯合剂分散法：一般只用于单层细胞的分散。：一般只用于单层细胞的分散。 分散细胞的方法分散细胞的方法l 1.单层细胞培养法单层细胞培养法 用胰酶将剪碎的组织或传代细胞分散成用胰酶将剪碎的组织或传代细胞分散成26个个成团的细胞，接种到培养瓶或培养板上，让细胞贴成团的细胞，接种到培养瓶或培养板上，让细胞贴壁生长，静置培养或转瓶生长培养。壁生长，静置培养或转瓶生长培养。 2.悬浮细胞培养法悬浮细胞培养法（搅拌培养）（搅拌培养） 通过振荡或转动装置使细胞始终分散悬浮于培养通过振荡或转动装置使细胞始终分散悬浮于培养液内的培养方法。液内的培养方法。3.微载体培养微载体培养 通过搅拌悬浮在培养液内，使微小细胞在载体表通过搅拌悬浮在培养液内，使微小细胞在载体表面繁殖成单层的一种细胞培养技术，兼有单层和悬面繁殖成单层的一种细胞培养技术，兼有单层和悬浮细胞培养的优点。浮细胞培养的优点。