蛋白质生物化学……考试题答案

1、7.02 2001 年秋季Ver1.02版蛋白质生物化学考试题答案1 .下面七种氨基酸，在每个氨基酸后面的横线上填上它对应的性质特征的字母。氨基酸性质甘氨酸（Gly）h ,ba）pH=7时带电荷苏氨酸（Thr）gb）非极性/疏水性脯氨酸（Pro）c ,d (b)c）亚氨酸苯丙氨酸（Phe）b ,d, ed）具内环状结构半胱氨酸（Cys）f ,(b, g)e）在 280nn&有吸收谷氨酸（Glu）a ,(g)f）后硫原子赖氨酸（Lys）a,(g)g）极性/亲水性h）具有最简单的侧链括号内的答案是正确但不是必需的。2 .某天生化学家小Johnny用7.02节的方法纯化 半乳糖甘酶，他遇到了

2、下面一些问题，请解释为 什么小Johnny的实验不能顺利进行，并帮他想想解决的办法。a） 在DEAEft子的穿过峰中有一半乳糖甘酶。这个问题的正确答案不止一个，包括：上样量太大，缓冲液pH值不合适，在蛋白样品或柱床中的缓冲液中含盐量太高（硫钱沉淀后的样品没有脱盐）。b） 聚丙烯酰胺凝胶电泳中上样时，样品从孔中扩散到电泳缓冲液中。上样缓冲液中的甘油非常重要，起增加粘度的作用，这可以阻止样品从梳样孔中扩散出来到电泳缓冲液中。c） 在一个新发现的蛋白 Namedoesh tmatter-ase 的硫钱沉淀后，小 Johnny重悬沉淀时，他检测发现没有活性，实验室的博士后用小 Jhonny的试剂并用和

3、他完全一样的方法重做硫钱沉淀这一步。这个博士后却得到了有活性的蛋白质，为什么？这是一个怪题，蛋白质可能还留在上清中而没有在下面的沉淀里，所以上清中才有酶的活性，小约翰并没有检测上清的酶活性，所以他发现没有活性！3 . 画出多肽asp val glu gly 的结构并圈出肽键。（参看附页）4 .判断下面的句子的对错，并用 T表不正确，F表不错误。T a ）当酶的催化速度是最大速度的一半时，Km= S。F b ）在凝胶过滤中，小分子物质最先流出来。F c）胶原蛋白的重复单元是ala -pro -hypoT d ）抗体的重链包括一个可变区和3个恒定区。T e）镰刀型贫血症是由血红蛋白 链上第6位的G

4、lu被Val代替引起。5 . a）画一个包括两个链（每个有个氨基酸（用 R1, R2, R3i. , R8表示这8个氨基酸的侧链）的反平行式折叠片层结构。（参看附页）b）圈出你画的结构图中所有的氢键结构。（参看附页）c ）片层的一侧有较强的疏水性，给出具有这种性质的三种氨基酸的全名： 丙氨酸, 缴氨酸 ， 亮氨酸 。d）在你画的结构图中圈出保证片层一侧具有强疏水性的必需的疏水性R基团。（参看附页）6 .简要说明SDS和 一疏基乙醇在蛋白质变性中的作用。SDS是兼性分子，由一个长的碳链和一个极性的、带电荷磺酸基团组成，它通过和蛋白质分子中的氨基酸发生疏水相互作用而使蛋白质变性，它还把蛋白质包裹起

5、来使蛋白质表面带负电荷。前基乙醇是强还原剂，可以断裂的二硫键（分子内和分子间）。7.02 Fall 2001 Protein Biochemistry Study Guide Key12蛋白质生物化学实验测验试题的参考答案问题#1 （共20分）说明下列试剂在PBC；验中的用途，（完整的答案需要简明扼要表述清楚什么实验中使用,使用的目 的和方法是什么）（每个4分）。a）溶菌酶 一种酶（不是洗涤剂也不是化学制品）， 在PBC第一天的实验中中用来裂解细菌细胞， 断裂细胞壁中的交连（细胞膜扣0.5分）。b） APTG 在纯化3-半乳糖昔酶的实验中亲和柱层析时使用， 是3 -半乳糖昔酶的底物类似物；3

6、-半乳糖昔酶能和它特异性地结合, 不被降解。c）硝酸纤维素膜 在蛋白质印迹（Western blotting ）实验中使用， 和蛋白质非特异性结合， 电流把蛋白质从凝胶中转移到膜上。d）碳酸钠（NazCO） 终止3-半乳糖甘酶催化的反应， 强碱，提高pH值，通过使 -半乳糖甘酶去折叠/变性终止反应， 并且帮助ONP显色。e） DTT （弱）还原剂（不是去污剂）， 用于缓冲液/溶液中（柱层析用的缓冲液）， 断裂非天然二硫键，促进蛋白质折叠，模拟细胞内环境（弱还原性）问题#2 （共19分）a） （8分）画出pH7.0时下面这个四肽的结构图:（N 端）Cys Tyr Lys一Glu （C 端）（参看

7、附页）侧链（6分）1.5分/AA;缺失或增加一个碳源子或R基团错误各扣0.5分，肽键（2分）肽键必须在一个平面上）（侧链交替）b） （1分）这个四肽的四个氨基酸中哪个能形成二硫键？半胱氨酸c） （6分） 螺旋的稳定是由于 氢供体 和 氢受体 之间的氢键的作用，在你在a）中绘制的结构图中用“D'（Df）标明氢原子供体，用" A" （ f）标明氢原子受体。（参看附页）侧链氢原子供体分主链氢原子供体分半胱氨酸被标扣0.5分d） （4分）下面是螺旋横截面图解，氨基酸 的侧链标为#,在你所知道的 螺旋结构的基础上，标出氨基酸# - 的侧链位置，（假想你通过螺旋的纵轴往下看，

8、末端在靠近你的这一端）顺时针：1分正确的顺序：3分假如氨基酸的位置碰巧正确的话，每个0.5分问题#3 （共14分）a） （8分）在下列水平上简单定义蛋白质结构,并从实验或讲义中各选择一个例子:二级结构定义（3分）一不考虑侧链的主链的构象，例子（1分） 螺旋（片层或转角）。四级结构定义（3分）亚基的空间排列（亚基=一个多肽链），亚基之间以非共价键相互作用的方式相连，有时它们之间存在二硫键。例子（1分）一血红蛋白的 个亚基等等。b） （6分）给下列分子中主要的三级结构单元命名:胶原蛋白分子：超螺旋，无规卷曲（3 个 螺环互相包装在一起）免疫球蛋白（如IgG）:扁平的3桶或 扁平的 3桶绿色荧光蛋白

9、（GFP 3 桶问题#4 （共12分）在7.02结束后，你决定在 Jean Tics博士的实验室做一个UROP Jean Tics博士想知道你对7.02中蛋白质纯化掌握的情况，所以她要你用实验室比较成熟的方法纯化PHM构酶。从细胞初提液（CL）开始，你采用下面的方法（并对得到的样品进行检测）：1 .硫钱沉淀（得到：“AS- P'）2 .用PD- 10层析柱脱盐（得到样品“ DEA日oad” ）3 . DEAEmi析（合并 DEAE部流出液彳#到样品“ DEAE total ” ）4 . PD-10脱盐后直接过亲和层析（得到样品“ AF after PD10 ” ）然后你检测每个样品的

10、PHM构酶的活性，得到下面的结果：样品体积(ml)蛋白浓度（mg/ml）蛋白总量（mg）酶活力单位（5比活提纯倍数CL25410020000020001XAS- p4104012000030001.5 XDEAE- load217.53510500030001.5 XDEAE total211226820031001.55 XAF after PD -10133600002000010Xa） （5分）在上面的表格中填写比活力和纯化倍数（在需要的地方注明单位） 比活：单位=U/mg （没有单位扣 0.5分）；每个比活0.5分， 提化倍数（没有单位）一每个 0.5分b） （3分）在这个纯化流程中哪

11、一步纯化效率最高？为什么？亲和层析（或第四步）的纯化效率最高（1 分） 。因为这一步有最高的提纯倍数（2 分） 。c） （4分）如果Tics 博士要你改进这个纯化工艺，你会去除哪一步？为什么？你可以通过去掉 DEAE柱层析（第3步）改进纯化工艺（1分）。因为这一步没有提高比活或提纯倍数，反而损失了大量蛋白（3 分） 。考虑到你在蛋白纯化方面掌握的已经很好， Tics 博士又给你了新得难题： 纯化并鉴定酶“ NoPBCas” e的野生型和突变体。准备好细胞初提液（CD后，你决定先通过硫镂沉淀纯化" NoPBCase。#5（共25 分）相信你在蛋白质纯化方面是一个行家， Dr.Tics

12、提出了一个挑战：纯化并辨别“ NOPBCas” e 酶的野生型与突变型。在你得到粗提液后（CL） ，你决定用硫酸铵沉淀“NOPBCas” e 。a） （4 分）简单描述硫酸铵怎么沉淀蛋白质。在溶液中，蛋白质被溶剂包裹（水和蛋白质表面电荷之间存在氢键和离子相互作用力） ，增加溶液中的盐离子浓度会干扰/ 破坏这种（水和硫酸铵的作用取代了和蛋白质的作用） （2 分） 。这样蛋白质分子间就会发生相互作用，逐渐聚集并从溶液中沉淀出来（2 分） 。如果写成“盐析” （给 1 分） ，对这个过程描述不完整的酌情给分。和你一起工作的博士后已经对NoPBCase故了一些原始的工作，她发现在40%的硫镂中这个酶会

13、完全沉淀。不幸的是，在计算应该加入多少AS 时你因为犯了个错误，配成了60的硫铵溶液！b） （3 分 ） 你估计这个错误会对硫铵沉淀后得到的样品ASP的总活力 （ T.A. ） 产生什么影响， 升高，降低，还是不变？为什么？ （答案 1 分，推理 2 分）我的答案是：如果在40%的硫镂中NoPBCase完全沉淀，那么我们预计在60%的硫镂溶液中不会有更多的酶沉淀，既然总活力反映的是目的酶的活力，我们预计ASP的总活力（ T.A. ）不会发生变化。如果有人认为因为变性蛋白质， TA 会降低（假定高盐会降低酶活力） ，也应得到满分。c） （3分）这个错误会怎样影响ASP的 比活（ S.A. ） （

14、升高，降低，还是不变）？并给出理由。 （答案 1 分，推理 2 分）比活=总活力/蛋白总量。总活力应该不会因为硫酸镂增加到60%而变化，但是由于硫酸镂增加到60，预计会有更多的蛋白质从溶液中沉淀出来。因此蛋白量会增多，比活（ “纯度” ）会降低。如果你认为因为酶的变性，总活性降低，在这里你也必须提到蛋白量的增多才能得到满分。在下一步，你决定采用离子交换层析，由于你几乎不知道关于NoPBCase的任何性质，你决定阴离子交换层析（DEARSephacel）和阳离子交换层析（CW纤维素）都试一试。每种介质各上一半的AS-P,并收集穿过峰（FT）,然后增大洗脱液离子浓度，使柱子上的蛋白质全部被洗脱下来

15、，并分步收集 记为15,最后，检测收集的每个样品的活性（NoPBCase可催化产生有颜色的物质的反应，该产物可 以通过检测在420nm下的吸收进行定量）。d） （7分）在下面不同的样品对应的吸收图中，如果 NoPBCase缓冲液条件中带正电荷，标出DEA L-Scph dice1FT FT 12 3 4 5开始增Jl 口盐浓度时CM-CcIIuIosl,NoPBCas e活性应该出现的最高点。简单说明你的理由。rr Ft 1 2 3 4 5开始增加!浓度时（每图1.5分，推理4分）DEAESephacel和其他的阴离子交换介质一样，会结合带负电荷的蛋白质，这样，在 DEAESephacel 层

16、析中，带正电荷的NoPBCase出现在穿过峰中；CW纤维素是阳离子交换介质，结合带正电荷的蛋白质，如NoPBCase它很可能会在中等的盐浓度梯度被洗脱下来（至于在什么盐浓度条件下被洗脱下来， 这取决于它表面所带的净电荷），因洗脱液中的阳离子能竞争性结合介质上的阴离子而把NoPBCasee换下来时，NoPBCase就被洗脱下来。如果你混淆了阴阳离子交换剂，但是你的推理比较正确的话将得到2分。最后你决定鉴定 NoPBCase的大小和结构，你发现在凝胶过滤中NoPBCase的分子量可能在120KDa（因为其在120KDa标准蛋白的流出位置处流出），接下来你和你的博士后同伴决定用你纯化的样品做蛋白质印

17、迹实验（Western blots ）。你们都先跑 SD4 PAGE电泳，然后一起用 NoPBCase抗体做 Western blots，你们的结果如下：你的结果120 kDa 11X) kDa 一80 kDa WkDn 120 kDa100 kDa-80 kDa4() kDae） （2分）你和同伴一起分析你们的结果，为什么不相同？当准备电泳样品时，你忘记往样品中加入还原剂（3疏基乙醇） ，而你的博士后同伴加了3前基乙醇，3 疏基乙醇还原了多聚蛋白之间和内部的二硫键，这样，她的样品被完全还原成单体形式，然而你的样品没有（任保持三聚体的形式）。（如果解释错误但是提到了单体和三聚体将得到1分）f）

18、 （6分）根据凝胶过滤和 SDJS-PAGE电泳结果，分析推测 NoPBCase的结构，并解释你的结论。凝胶过滤测得这个天然蛋白的分子量是120KDa加入还原剂后出现了40KDa的单体，同时在免疫印迹中看到三倍的量。这符合寡聚体蛋白的结构模式，因此可以推断这个蛋白是由三个40KDa的单体通过二硫键连在一起的三聚体蛋白。问题#6 （共10分）最后你得到了一些纯的NoPBCase准备做酶促动力学，决定用NoPBCase天然底物的类似物ONPB （NoPBCas催化下面的反应：ONPBf ONPF显色的物质）。你用不同的ONP底物浓度开展的酶促动力学l/S(JiiLnmQl)OIPEJM。一ounl/PHy二实验（用7.02lab方法），（并检测产物ONPE 420nmF的吸收），下面是你在第一次实验中用野里|L NoPBCasea） （6分）计算野生型 NoPBCase的Km和Vmax详细写出推翻过程，且不要忘记单位！（每个正确的计算2分，正确的单位1分，）在Lineweaver