细胞工程实验讲义

1、细胞工程实验讲义哈尔滨商业大学食品工程学院生物工程专业实验一番茄的胚轴、子叶培养一、实验目的愈伤组织的诱导和止确地运用激素诱导形态建成是植物组织培养 中最常用的基本技术，通过实验使学生们了解这一操作过程的要点与技 能，及快速繁殖的技术过程。二、实验原理高等植物细胞具有全能性，在高等植物细胞分化过程中，即使是高度 分化的植物细胞，它们的遗传潜能并没有丧失，仍保持着潜在的全能性。 已分化成熟的活细胞在一定的营养因素作用下，有可能恢复遗传全能性， 类似合子的发育功能，由单细胞发育成胚装体，继而形成完整的植株。在 植物组织培养中，激素在愈伤组织的形成及形态建成中起着重要作用。在 一定的范围内，生长素/

2、激素的比例高时，产生根，反之则产生芽。通过变 换激素的种类和浓度，能有效地调节培养组织的器官分化。二、实验用品（一）、器材超净工作台、培养箱、工形镀子、解剖剪刀、三角瓶、培养皿、滤 纸、酒精灯、脱脂棉、烧杯、量筒、封口膜、振荡培养膜、（二）、试剂ms基本培养基、次氯酸钠、iaa、ba、蔗糖、乙醇、去离子水、1mol/lhcl、 1mol/l naoh（三）、材料“美国大红”番茄种子三、实验准备培养基配制在植物组织培养使用的培养基中，涉及的药品较多，而且许多微 量元素在配制培养基时不能直接称取，故为了方便培养基的配制以及 减少微量元素的称量误差，常常在配制培养基前先配制培养基的母 液。植物组织培

3、养基的母液分为大量元素母液、微量元素母液、维生 素母液和各种激素母液等。1、ms培养基母液配制成分1 x20 x(1)、大量元素mg/lg/lnh4n03165033kn03190038caci2. 2h204408. 8 （无水 6. 64）mgs04. 7h203707.4kii2p041703.4(2)、微量元素ix100xki0. 8383mgh3b036.2620mgmns04. 2h2015.61560mgzns04. 7ii208.6860mgcus04.5h200. 025250mgcoc12. 6h200. 025250mgna2mno4. 2h200. 2525mg(3)、

4、铁盐200 xfes04. 7h205. 57gna2edta. 2h207. 45g(4)、有机ix100x肌醇100loooomg烟酸0. 550mg甘氨酸2200mg维生素b10.440mg维生素b20. 550mg注：配制铁盐溶液时，将二种纱品分别置于450ml的蒸憾水中，加热并不断搅拌，使之溶解，然后将二种溶液混合，把ph值调到5. 5o最后加重蒸懾水定容到最终容积1000mi o每升培养基取5ml(5ml/l)o2、ms培养基的配制1000mi培养基取大量元素(20x) 50ml1000ml培养基取微量元素(100x) 10ml1000ml培养基取有机(100x ) 10ml100

5、0ml培养基取铁盐(200x) 5ml1000ml培养基加蔗糖30g1000ml培养基加琼脂粉8-10g加蔗糖、琼脂粉、定容到1000ml,用naoh或lmol/l hcl调ph值为5. 8。加热培养基，并分装于三角瓶(100ml的三角瓶装25-30ml培养基）中在120°c、0. impa高压灭菌锅灭菌15min备用。3、愈伤组织诱导培养基ms基本培养基+0. 2mg/l iaa+2mg/l ba+蔗糖+琼脂，调ph值到5. 8。 加热培养基，并分装于培养皿中,每jhl 20ml培养基，灭菌15min备 用。四、实验方法与步骤（一）、发无菌苗1、种子消毒取番茄种子于50ml小烧杯中

6、用70%乙醇中消毒0. 5-1 min,倒去 乙醇，用滤纸吸干。用无菌水冲洗3-4遍，弃去无菌水，用滤纸吸干。 再以10%次氯酸钠表面消毒8-12min,用滤纸吸干。然后用无菌水冲 洗4-5遍，于28°c无菌水浸泡24h。2、接种将浸泡好的番茄种子，用滤纸吸干，用工形银子接种于培养基上, 每个100ml三角瓶接20粒种子。3、培养无菌苗将接种的蒂茄种子与25-28°c下培养，4-5天后，无菌苗长到三 角瓶的瓶颈处。（二）、诱导愈伤组织1、制备外植体：取番茄无菌苗，用解剖剪刀将无菌幼苗及胚轴剪 成0. 5cm左右的若干段，形成外植体。2、接种：用工形锻子将外植体接种到愈伤组织

7、诱导培养基上，每个培养皿接20块。3、培养：将接种的材料置于培养室中，25°c下培养。3-4天后, 在外植体的四周和上表面将形成愈伤组织。记录愈伤组织出现的时 间。五、实验结果将实验结果填入下表。表愈伤组织诱导率及污染率统计表取材部位接种外植体数愈伤组织形成时间愈伤组织诱导率()外植体完全长成愈伤组织率(%)污染率(%)幼叶胚轴六、思考题统计污染率，找出导致污染的可能原因。实验三小麦成熟胚的培养一、实验目的通过实验，使学生进一步掌握组织培养的基本操作程序，并了解 植物胚胎培养的技术关键。二、实验原理与其他类群的植物不同，被子植物的受精过程是双受精（double fert订izatio

8、n）,即进入胚囊的花粉管中两个精子，一个与卵细胞结 合形成合子，另一个与中央细胞的两个极核结合形成初生胚乳核。合 子进一步发育形成胚胎，而初生胚乳核发育为胚乳组织，为胚胎提供 营养，并在种子成熟过程中或种子萌发过程中逐渐解体和消亡。在自然状态下，许多种植物的种皮对胚胎萌发有抑制作用，需要 经过一段休眠，待这种抑制作用消除，种子方可萌发。若从种子中分 离出成熟胚进行培养，可以完全解除种皮的抑制作用，使胚胎立即萌 发。成熟胚已经储备了能够满足自身萌发和生长的养料，因此在简单 的培养基上就可以培养，使其形成愈伤组织，并进一步诱导分化为完 整植株。三、实验用品（一）、器材超净工作台、显微镜、工型银子、

9、接种针、解剖刀、三角瓶、烧 杯、量筒、移液管、培养皿、高压蒸汽消毒锅、酒精灯、培养箱、载 玻片、盖玻片等。（二）、试剂ms培养基、2、4d、琼脂粉、蔗糖、70%乙醇、1mol/l hcl、1mol/l naoh、0. 1% hgci2、（三）、材料成熟的小麦种子。四、实验准备培养基制备1、ms培养基制备同实验一。2、愈伤组织诱导培养基制备ms培养基+30g/l蔗糖+2mg/l 2、4d+0. 8%琼脂粉，加热培养基, 并分装于培养皿中，每皿20ml培养基，灭菌15min备用。五、实验方法与步骤1、材料准备取成熟的小麦种子在50ml烧杯中用70%乙醇消毒lmin,用滤纸 吸干；再以0. l%hg

10、c12消毒8min,用滤纸吸干;然后在培养皿中（温 水28°c）浸种36h,使胚乳软化。2、外植体的获得将浸泡好的小麦种子用滤纸吸干；以70%乙醇消毒0. 5min,用滤 纸吸干;用无菌水洗3-4次,用滤纸吸干;在用0. 1% hgc12消毒12min, 用滤纸吸干；之后用无菌水洗5-6次，用滤纸吸干。用解剖针剥离出 成熟胚。由于外植物形态的不同，选用的消毒剂及消毒吋间及程序有所区 别。表面光华的外植体，处理时间短；反之，则时间长些。但由于hgc12有毒，常附在外植体表面不易被冲掉。但其消毒彻底。3、接种将成熟胚接种于愈伤组织诱导培养基上，每皿接种20-30个胚。4、培养于26

11、76;c左右进行暗培养。2-3d后，即可看到愈伤组织的形成。六、实验结果五、实验结果将实验结果填入下表。表愈伤组织诱导频率取材部位接种外植体数愈伤组织形成吋间愈伤组织诱导率（）外植体完全长成愈伤组织的频率（）污染率（%）成熟胚六、思考题在小麦成熟胚的培养过程屮，制备外植体时，为什么要用hgc12进行处理？试总结植物组织培养材料消毒灭菌的原则。附录：组织培养的设备和基本方法一、实验室及设备细胞工程研究的主要内容是细胞培养和细胞的遗传操作，因此首 先要建立一套能够顺利开展工作的细胞和组织培养实验室。实验室一 般由培养基制备室、无菌操作室、培养室和显微工作室四部分组成。1、培养基制备实验室培养基制备

12、实验室由洗涤间、培养基配制间和消毒间三个房间组 成，分别进行器1111的洗涤与烘干、培养基的制备与培养基的消毒等工 作。其中培养基配制间应配制的主要仪器设备有冰箱、天平、ph计 （酸度测定仪）等。冰箱用于储存培养基母液、贵重药品、保存实验 材料等。消毒间要配备电热炉或微波炉和高压灭菌锅。高压灭菌锅用 于培养基、无菌水、玻璃器皿及小工具的灭菌。2、无菌操作室无菌操作室又叫接种室。接种室内主要安放超净工作台。超净 工作台有单人使用和双人同时使用二种。超净工作台中需要准备一些 接种用的小器具，如锻子、接种针、解剖刀、手术剪刀、酒精灯、贮 存浓度为70%的酒精棉球的广口瓶、以及消毒材料用的乙醇、次氯酸

13、 钠溶液、废液缸等。二、器皿的选择与清洗1、配制培养基需要的器皿配制培养基需要的器皿有：容量瓶：规格有25ml. 50ml. 100ml和500ml等用于配制和储存母液；量筒:规格有 lml、5ml、10ml > 25ml > 50ml > 100ml、500ml 和 1000ml等，用于量取母液和培养基的定容。带刻度的烧杯:规格有25ml、50ml> 100ml和1000ml等;搪瓷 量杯容积为500ml和1000ml,用于培养基的制备和定容积。漏斗：直径为4-5cm,用于分装培养基。吸量管：规格有0.1ml、02ml、0.5ml、lml、5ml和10ml等用 于吸取

14、母液。微样加量器：各种规格并配备吸管，用于吸取微量的母液，配制 培养基。2、细胞组织培养用的器皿三角瓶：适宜做各种材料的培养，是组织培养汇总最常用的、要 求数量较多的玻璃容器。一般用50ml和100ml二种，口径为 2. 5-3. 5cm,瓶口稍大便于操作。试管：特别适用于少量培养基及试验各种不同配方吋用，在茎尖 培养、胚培养及诱导芽形成小植株时，有利于小植株向上生长。规格 以2. 5x 15cm为宜，过长过细不利于操作。培养川l：用于固体表面培养，规格为直径3cm、6cm和8cm等。 植物组织和细胞培养的周期比微生物培养的长，一般选择较高的培养 皿，需要的吋候多加-些培养基或培养液。离心管：

15、在离心机上用于收集和制备花粉、细胞、原生质体的悬浮液，可以在离心管中进行短吋间的培养，再转入其他培养器中。3、3、玻璃器皿的清洗三、培养基的配制在进行细胞工程研究时，离体细胞的生长、分化和植株再生都是 在培养基中进行的，因此选择和配制培养基是细胞培养的重要环节。 培养基的种类很多，但各种培养基都是由含大量元素的无机盐、含微 量元素的无机盐、碳源、维生素和氨基酸以及激素等五大类成分构成。基本培养基是指不含激素的培养基。培养基中各成分的浓度一般 以mg/l或g/l为单位。1、母液的配制为了避免每次配制培养基都要称量各种化学药品，常常把培养基 中必需的一些化学药品，按原量的浓度增大10倍、100倍或

16、1000倍 后称量，配成一种浓缩液，这种浓缩液叫母液。分为大量元素母液、 微量元素母液、铁盐母液、维生素与氨基酸母液（或有机母液）和植 物激素母液。常用的植物激素有二大类,一类是生长素，另一类是细胞分裂素。 常用的生长索有2, 4d、荼乙酸（naa）、口引味乙酸（iaa）、口引喙丁 酸（iba）等；常用的细胞分裂素有激动素（kt）、6-节基卩票吟（6-ba） 和玉米素（zt）。配制激素母液应当单独称量，分别配制母液，母液 的浓度一般为01-加g/mlo这些激素类物质一般不溶于水，生长素 类物质应先用少量0. lmol/l氢氧化钠溶解后，再在容量瓶中用蒸憾 水稀释到所需浓度。细胞分裂索类物质则需

17、要加lmol/l盐酸少许先溶解，然后再加蒸憾水到所需浓度。母液配好后应及时标注名称、配制时间、浓度，并放在4°c冰箱 中保存2、培养基的配制程序在细胞组织培养实验中，培养基配制上的错误所造成的问题比任 何其他技术过失所造成的要多，因此必须按规定严格认真地进行配制 培养基的操作。为了尽可能不出差错，应当把培养基中各个成分都写 在纸上，加进一个成分及时划掉一个。每个装有培养基的培养器皿都 应当清楚地做上标记，以免遗忘或混淆。制备高温消毒的培养基的步骤如下。 、称出规定数量的琼脂和蔗糖，加水到培养基最终溶剂的3/4, 在电热炉上加热，使之溶解。 、根据配方的要求，按顺序用量筒或移液管吸取大

18、量元素、微 量元素、铁盐、有机、激素等各种母液中取出所需要的各种母液，放 在干净的烧杯中。 、将煮好的琼脂和蔗糖倒如盛有各种母液的烧杯中，加蒸馅水 定容到培养基的最终容积，同时不断搅拌使其均匀。用0. imol/lnaoh 或 0. lmol/l hc1 调 ph 值至 5. 6-5. 8。 、把培养基分装到所选用的培养容器中。 、将装有培养基的培养容器用封口膜封好，并表明培养基标号。 、将培养容器放进灭菌锅，120°c (104kpa)下灭菌15-20min。取出培养基在室温下冷却备用。如近期不用，可放在冰箱中保存。或将培养基装在250ml的三角瓶中（装200ml）,先灭菌、再冷却到60°c,在超净工作台中分装。四、材料器