3第三讲限制性酶切方式及连接

1、 限制酶切方式及连接1.1 单酶切1.2 双酶切1.3 部分酶切1.4 完全酶切1.1 单酶切 若dna样品是环状dna分子，产生与识别序列（n）相同的dna片段数。 若dna样品是ldna片段，完全酶切产生n+1个dna片段。 1.1 单酶切 酶切体系： 13l ddh2o 反应体系 2l 10buffer 4l 底物dna 1l 限制酶 总体积：20l 酶切步骤： 加样； 摇匀，短时离心； 反应13h； 反应终止。 65水浴1015min1.2 双酶切 用不同的限制酶切割同一dna分子的方法。 环状dna分子完全酶切的结果，产生dna片段数是两种限制酶识别序列数之和。 线性dna分子完全酶

2、切的结果，产生dna片段数是两种限制酶识别序列数加1. 双酶切可以在不同的反应系统中进行。a 需要较低盐浓度的酶先切割，然后升高盐浓度，另一个酶切割；b 最适反应温度较低的酶先切割，然后升高温度，另一个酶切割；c 第一个酶切割后，经凝胶电泳回收dna，再选用合适反应系统，进行第二个酶的切割。 d 双酶切在同一个反应系统中。 1.3 部分酶切 指限制酶对其在dna分子上的全部识别序列进行不完全的切割。 用途：当某种限制酶的多个识别序列之中有一个识别序列恰好在回收待用的dna片段上，若完全酶切，将此dna片段从中切断。 为了解决这个问题，就需要用到部分酶切，以满足实验的需要。 2 限制酶切后的连接

3、2.1 dna ligase: 能催化dsdna片段紧靠在一起的3羟基末端与5磷酸基团末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接的一种核酸酶。目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶t4 dna ligase重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连2.2 dna片段之间的连接 具互补黏性末端之间的连接 具平末端之间的连接5ggactg-0h p-aattctgcaa-33cctgacttaa-p 0h-gacgtt-5 e.cor i 切割 e.cor i切割 dna ligase 5ggactgaattctgcaa-3 3cctgacttaagacgt

4、t-5 e.cor i 识别序列结论： 待连接的两个dna片段的末端如果是用同一个酶切割的，连接后仍保留原限制酶的识别序列。 bam h切割反应切割反应 ggatcc cctaggt4 dna ligase gatcc ggcctag目的基因用目的基因用 bam h切割切割gcctaggcctaggcctaggcctaggatccggatccggatccggatccg载体载体dna用用bam h切割切割gcctaggcctaggcctaggcctaggatccggatccggatccggatccg重组体重组体gcctaggcctaggatccggatccggcctaggcctaggatccgg

5、atccg载体自连载体自连目的基因自连目的基因自连同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接不同限制酶切位点的连接不同限制酶切位点的连接gaattccttaagagatcttctagaeco r切割位点切割位点gcttaaatctagaattcggatctabg l切割位点切割位点aattcgatctagaattcggatctaaattcgatctagecor+ bg l双酶切双酶切eco r+ bg l双酶切双酶切gcttaaatctagaattcggatctat4 dna ligase 重组体重组体 5caagctca3 5gtagctta3 3gttcgagt5 3catcgaat5 alui alui p-ctca-3 5caag-oh p-ctta3 5gtag-oh oh-gagt5 3gttc-p oh-gaat-5 3catc-p t4 dna ligase 5ca agct ta-3 3gt tcga at-5 alui agct hind aagctt结论： 如果