霍山石斛微卫星引物的SDS-PAGE的检测与方法探讨

1、本科学生毕业论文（设计）题目 霍山石斛微卫星引物的SDS-PAGE的检测与方法探讨学院 生命科学学院 专业 生物科学 学生姓名 姚宗莉 学号 0810366 指导教师 王晖 职称 副教授 论文字数 5,375 完成日期 2011 年 3 月 25 日目录1 摘要1 2 引言13 材料和方法2实验材料2试剂和仪器3试剂的配制3实验仪器3实验方法34 结果与分析4实验结果4结果分析85 讨论86 参考文献107 致谢信11霍山石斛微卫星引物的SDS-PAGE的检测与方法探讨 姚宗莉，生命科学学院摘 要：霍山石斛(Dendrobium huoshanense)为兰科石斛属多年生草本植物，其干燥茎或鲜

2、草可药用。为了筛选和检测石斛属不同种之间微卫星的多态性，采用PCR方法扩增石斛属基因组上的微卫星序列后，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。采用银染法对微卫星位点进行多态性检测，该方法具有灵敏度高，污染小，无毒害，条带清晰等突出特点。能有效地控制染色背景，显著提高检测分辨率等。关键词：霍山石斛；微卫星；PCR;银染；变性聚丙烯酰胺凝胶电泳Discussion on the Dendrobium huoshanense microsatellite primer detected by SDS-PAGE and methods Yao zongli, College of Life SciencesA

3、bstract: Dendrobium huoshanense of huoshan is one of Orchid Dendrobium perennial herb.Its dry stems or fresh can use for medicinal.For screening and detection of Dendrobium of the different between the microsatellite polymorphism and PCR amplification of microsatellite sequences in the Dendrobium in

4、 genome analysis is denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. Using silver staining method for microsatellite loci were polymorphic detection, the method has the advantages of high sensitivity, small pollution, no poison, with clear characteristics. And can effectively control the staining back

5、ground, and significantly improve the detection resolution.Key words: Dendrobium huoshanense，Microsatellite (SSR); PCR;silver staining;SDS-PAGE1 引言：霍山石斛(Dendrobium huoshanense)为兰科石斛属多年生草本植物，其干燥茎（又名霍枫斗）或鲜草可药用，具有抑制肝脏细胞中胆固醇合成，而且还具有抑癌活性，有利于防治心血管系统疾病和防癌抗癌作用，是常用的大宗药材。霍山石斛（即米斛），由于其功效奇特，资源稀少，价格昂贵，素有“千金草”、“软

6、黄金”的美誉，目前国内外市场上真正地霍山石斛基本上没有，所存在的均是挂名“霍山石斛”的黄草石斛等常规类药物。 霍山石斛是安徽道地药材之一，其自然分布区相当狭窄，主产于安徽霍山县，一直处于濒危状态很难找到野生的霍山石斛。微卫星(microsatellites) 是以1个6个核苷酸为单位的多次串联重复DNA 序列,其中两核苷酸的重复频率最高。微卫星又被称为 SSRs （simple sequence repeats ,简单序列重复）或 STRs （short tandem repeats ,短串联重复序列）或 STRP (short tandem repeat polmorphism ,短串联重复

7、序列多态性) 或SSLP（simple sequence length polymorphism ,简单序列长度多态性）等。它具有数量多、分布广（不仅存在于内含子中,也存在于编码区及染色体上的其它任一区域） ,多态性丰富,个体专一性强,分析操作简便、快速,重复性、准确性和稳定性好,呈孟德尔式共显性遗传等优点。 微卫星 PCR 扩增后用聚丙烯酰胺凝胶电泳是现代分子生物学的常用方法 ,因为它分辨率高,可以分离只有 1 个碱基 bp差别的不同DNA 片段,广泛 应用于DNA 序列测定和短串联重复序列( STR )等的研究。经聚丙烯酰胺凝胶电泳后的 DNA 若不经处理就观察不到条带，对PAGE处理的方

8、法中以同位素标记、放射自显影最为敏感，溴化乙锭染色方法最简单，但同位素放射性和强诱变剂溴化乙锭对人体有毒害作用，处理繁琐，需要特别设备和防护措施，而且两者的废弃物会污染环境，难于处理。因此，本实验采用安全无毒而又敏感性好的银染显色法。中药分子鉴定是近年来发展的从分子水平鉴定中药的方法，能从DNA水平反映中药的遗传特征，具有准确性高、特异性强的特点，不受季节、产地的影响。目前国内外学者对霍山石斛的研究主要集中在化学成分、药理作用和临床应用上，霍山石斛在分子领域的研究还是比较少。近年来发展起来的分子标记技术为品种鉴定开辟了广阔的前景， SDS-PAGE分析速度快、操作简单、试验费用低而且可以在没有

9、任何遗传背景的基础上用于物种分类和品种鉴定研究。本试验首次采用SDS-PAGE技术对霍山石斛进行分析，旨在为霍山石斛分子鉴别提供依据。2 材料和方法2.1 材料 表一：研究材料的采集:居群采样个体数采样部位采样地点 霍山石斛40叶片霍山县太平畈乡 铜皮石斛15叶片霍山县太平畈乡 铁皮石斛10叶片霍山县太平畈乡，湖北英山 河南石斛25叶片霍山县太平畈乡，湖北英山 扁黄草石斛5叶片霍山县太平畈乡，湖北英山 钩状石斛6叶片霍山县太平畈乡，湖北英山2.2 试剂和仪器2.2.1 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂PCR反应体系：反应体系为15L，6ul的专用loading buffer，DNA样品3ul，去离子

10、水3ul，然后在PCR扩增仪中95温度下变性5min，4条件下保存。表二：变性聚丙烯酰胺胶的配制：试剂名称加入剂量Urea（尿素）31.2g40%acrylamide/bis16mlddh2O加至80mlTEMED40ul，一般取45ul搅拌，待完全溶解后，再加入10%APS10%APS400ul,一般取450ul固定液： 100ml无水乙酸加纯水至1L.银染液：1g AgNO3加纯水至1L.（使用前按照1.5ML甲醛/1L染色液加入甲醛）显影液：30gNa2CO3加纯水至1L.（在使用前按照1.5ML甲醛/1L显影液加入甲醛，加入硫代硫酸钠使浓度达到2mg/L,加0.2ml）.40%聚丙烯酰

11、胺溶液：丙烯酰胺（Acrylamide）：双丙烯酰胺（Bis-acrylamide）=19:1.称取丙烯酰胺38g和双丙烯酰胺2g，加入双蒸水，定容到100ml，4°C保存.10mg/ml硫代硫酸钠：0.7848g五水硫代硫酸钠加水定容至50ml，避光保存.10%APS：1gAPS溶于10ml水中.10×TBE Buffer：Tris 108g，硼酸 55g，EDTA 9.3g，加水定容至1L.6×loading buffer:溴酚蓝 250mg，二甲苯氰 250mg，甘油 30ml，定容至100ml，然后按1:9加入变性剂. DNA样品，DNA Mark,专用l

12、oading buffer，无水乙醇，乙酸，疏水性硅烷，亲水硅烷，去离子水，琼脂糖凝胶，石蜡油等.2.2.2 仪器变性检测系统（374BR 3501）,电泳仪（DYY-6C型），电子天平（HX202T）,微量移液枪，PCR扩增仪，超纯水器，凝胶成像系统等.2.3 试验方法（1）清洗玻璃板取大、小玻璃板各两块，用蘸有单蒸水的脱脂棉单方向使劲擦洗玻璃板，再用干的脱脂棉将玻璃板擦干.（2）涂硅烷在涂硅烷以前，用蘸有无水乙醇的洁净脱脂棉单方向使劲擦洗大、小玻璃板，用干的脱脂棉将玻璃板擦干，直至各玻璃板完全洁净.吸取1ml疏水性硅烷滴加在大玻璃板上，立即用脱脂棉稍用力把疏水性硅烷在大玻璃板上涂匀，然后单

13、向轻轻地将之涂干.将乙醇和乙酸的混合溶液（其中95%乙醇5%乙酸）和亲水性硅烷以1000:1的体积比（2ml：2ul）混匀制作亲水性硅烷工作液，一块小玻璃板各取1ml工作液。将1ml工作液滴加到小玻璃板上，立即迅速用把亲水性工作液在小玻璃板上涂匀、涂干.用蘸有去离子水的干净脱脂棉擦洗大玻璃板，然后用干净的脱脂棉擦干玻璃上的水分，以备用.用蘸有无水乙醇的干净脱脂棉擦洗小玻璃板，然后用干净的脱脂棉擦干玻璃上的水分，以备用.（3）装板将小玻璃板清洗的一面同大玻璃板干净的一面相对。（4）上架用夹玻璃板的架子对齐并固定，装入垫好海绵垫子的支架底座内，固定。（5）变性聚丙烯酰胺凝胶的配制及倒胶将配制好的胶

14、液连续倒入两玻璃板的夹缝中，再将洁净的梳子插入胶液中，静置1-1.5小时。（6）预电泳50，250V，预电泳20分钟。（7）上样，正式电泳关电后15S打开盖子，注射器冲洗点样孔，4 l PCR产物中加入4l Loading Buffer变性8l样品点样，点Mark盖上盖子，250V,电泳5h。（8）固定小玻璃板经单蒸水清洗后，使胶面朝上，再加入10%的乙酸固定的20分钟。（9）银染将固定液倒掉，用单蒸水清洗3次，加入银染液，避光条件下，银染30分钟。（10）显影倒掉银染液，用单蒸水清洗3次，加入显影液，避光，一般5-10分钟即可显示出条带。（11）固定当条带显示清楚后，用10%乙酸固定液，再次

15、固定，终止染色。在凝胶成像系统中拍照，保存。3 实验结果选取几种以下引物扩增的样本经大量的SDS-PAGE凝胶电泳实验，得到的图谱如下： 图1：Hs-39引物聚丙烯酰胺凝胶电泳 M1、2：DNA Marker1-12泳道：1-12号个体PCR产物银染结果 图2：Hs40引物聚丙烯酰胺凝胶电泳M1：DNA Marker1-12泳道：1-12号个体PCR产物银染结果 图3：Hs41引物聚丙烯酰胺凝胶电泳M1、2、3：DNA Marker 1-15泳道：1-15号个体PCR产物银染结果图4：Hs57引物聚丙烯酰胺凝胶电泳M1、2：DNA Marker 1-16泳道：1-16号个体PCR产物银染结果

16、图5：Hs44引物聚丙烯酰胺凝胶电泳M1、2：DNA Marker1-13泳道:1-13号个体PCR产物银染结果图6：跨种扩增-41引物聚丙烯酰胺凝胶电泳M1、2：DNA Marker 1-3号泳道：1-3号个体（霍山石斛）PCR产物银染结果4-6号泳道：4-6号个体（铜皮石斛）PCR产物银染结果7-9号泳道：7-9号个体（铁皮石斛）PCR产物银染结果4 结果与分析4.1 结果 Characteristics of five microsatellite loci isolated from Dendrobium huoshanense.表三：五个霍山石斛微卫星位点的引物序列、重复单元、退火温

17、度及等位基因的数量：LocusPrimer sequence (5-3)Repeat motifTa (°C)NAHs39*F:CACCGCTTGTCCATCAAACTTCR:CGCAATGGTTGAGCGTGTAAAT(TC)26614Hs40F:AAGATTGAGGCGATGTTGTR: ACTTGCTGGAATTTGTGGT(TC)20613Hs41F: CAGGCGGCAGAGTTACAGR:GCCAAAGCAAAACAAAGTAGAGAG)26553Hs44F: ATGGCATAAAACCTCCCCGR: GAGCGGACAATCGCATCTAAGT(CT)16554Hs5

18、7F: CCTTGAATTTGCATGGAGTTR: TTTTGGGGCATTTTGCTGTT(TC)22522NA is the number of alleles; Ta is the optimal annealing temperature.经观察发现该实验所取样本，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后，结果显示条带有两种情况：两条和一条带，不单一，且许多不在一条水平线上4.2 分析由结果显示的条带可以说明，在所取的实验样本中，样本有杂合子和纯合子，并具有多态性。其中，结果显示两条带的是杂合子，结果显示只有一条带的为纯合子。霍山石斛存在一定的种内变异，其变异类型从形态上分化不明显。铜皮石斛，铁皮

19、石斛，扁黄草石斛，钩状石斛与霍山石斛及河南石斛有较大差异。这些差异为研究霍山石斛遗传多样性、基因流动、演化规律提供有利的工具。这些差异可以为上述几种石斛属植物的遗传多样性、保护遗传学、以及石斛属植物之间亲缘关系的研究提供参考依据。5 讨论银染检测的方法安全且试验周期短 ,但从胶板的前期处理到最后的显色,整个银染检测技术流程长 ,但因其灵敏度高，操作时间短，在实际操作中出现的一些问题常常会影响最终的检测结果，而通过实验发现影响银染检测效果的因素非常多,许多意想不到的因素都会影响最后的银染效果 ,导致带型异常 ,难以统计。通过大量的试验,发现可能会影响实验结果中条带的显示的主要有以下因素：5.1

20、模板质量模板定量不准，抽提不纯，4 存放时间过长DNA降解等都会影响PCR的扩增效果。本次试验所用DNA样品的提取结果较好，但是有的样品由于存放时间稍长，至使有的条带结果显示不清晰。由此可见，模板的质量也是影响结果的一个重要因素。5.2 引物质量设计引物时，要防止两个引物的3端含有互补序列，否则会发生退火，聚合 酶就会把引物延伸到另一引物的末端而形成引物二聚体，可通过改变MgCl2浓度使含量大大低于目的产物。本次试验的引物设计由专业的公司完成，故质量较好。5.3 退火温度提高退火温度能有效减少非特异性带，但若减少太多会影响PCR产物量，特异性带将变暗。5.4 玻璃板的处理每次电泳前都要对电泳装

21、置，尤其是玻璃板彻底清洗。依次用自来水、超纯水、无水乙醇擦拭干净，自然干燥。保证玻璃板上没有其他污染物。否则，玻璃板上的一点脏污都会导致实验结果的条带显示。另外玻璃板的平整程度很重要，若玻璃板的边缘有缺口，在胶干燥的过程中会导致漏胶，解决办法是不停地补胶。5.5 试剂的存放 过硫酸胺（APS）在理论上应现用现配 ,也可于4 避光条件下保存 12 周。TEMED 在 4避光保存。10×TBE缓冲液浓度高,常温下容易结晶,可以用 5×TBE代替 10×TBE置于4贮存。丙烯酰胺与甲双丙烯酰胺在贮存过程中,因光或碱的催化 ,会慢慢转变成丙烯酸或双丙烯酸,故应经常检查丙烯

22、酰胺溶液的pH值是否小于7.0为此,常将它装入棕色瓶中,置于4保存 ,新配制的溶液一般使用 2个月。5.6 点样点样之前要用医用针管吹去点样孔内的杂质，吹的时候针管尽量插到底部，重复3到6次即可，否则会导致带型分散。另外点样量应适中，过多会导致条带分散，过少会导致条带不清晰。5.7 银染后凝胶不着色 通常导致银染后凝胶不着色的原因是硝酸银失效。由于硝酸银见光易分解 ,常被保存于棕色瓶中。如果保存不当,会导致染色后胶背景偏黄 ,甚至不着色。因此要保证每次银染前染色液新鲜配制，不可将染色液重复使用。染色后用去离子水漂洗的时间要严格控制在5-10s，否则会使结果条带显示不清晰。电泳缓冲液重复使用次数

23、过多，也会使结果条带显示不清晰，一般缓冲液最多可重复使用8次，就需要重新配制缓冲液。5.8 染色后凝胶背景深1）整个银染色过程应采用不含杂质的超纯水或者是双蒸水 ,以免影响扩增信号的减弱.2）严格控制显色时间,做到长短适中,显色时间过长或过短都会影响对最终结果的判定。3）电泳后 ,染色前冰乙酸的固定时间不应过长。虽然理论上可以过夜 ,但也会加深染色后凝胶的背景。4）显色过程中硫代硫酸钠起敏化作用 ,可以防止自由银离子还原为金属银 ,否则会增加背景。5）显色液温度和显色时摇床的摇动速度直接影响着显色反应的速度。因此显色液应控温在4 左右 ,摇动不要太快 ,以方便控制显色时间参考文献：1 张志峰，史洪才，武坚，简子健.微卫星DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）银染法的改良.BIOTECHNOLOGY，2005,15（3）:51-53.2 张军，武耀廷，郭旺珍等.棉花微卫星标记的PAGE/银染快速检测J.棉花学报,2000,12(5):267-269.3 吕海航，郑国萍,等. 微卫星电泳及银染检测中的常见问题分析及对