免疫学技术在食品检测中的应用

1、免疫学技术在食品检测中的应用 食品安全问题在 21 世纪的今天已经成为全世界关注的重大问题， 对国家的经济发展和消费者的身体健康产生了重大影响。 由于食品种 类丰富，食品中检测的有毒有害物质种类和组分繁多， 需要检测的物 质质量极低，样品中待检物的浓度常为a g、ng甚至pg级，除此之 外，许多检测物除需检测物质本身，还涉及其衍生物和降解物测定。 区别同位异构体以及元素的价态等。 因此食品检测要求检测方法更加 准确、快速、方便。 1959 年， Yalow 和 Berson 将发射性同位素示 踪与免疫反应相结合建立了发射免疫测定法， 从而开创了免疫分析这 一崭新领域。 现在， 免疫学检测技术是

2、食品检测技术中的一个重要组 成部分，特别是三大免疫技术荧光免疫技术、 酶免疫技术和放 射免疫技术在食品检测中得到了广泛应用。 利用免疫学检测技术可检 测细菌、 病毒、真菌、各种毒素、 寄生虫等， 还可用于蛋白质、 激素、 其他生理活性物质、药物残留、抗生素等的检测，其检测方法简便、 快速、灵敏度高、特异性强，特别是单克隆抗体的发展，使得免疫检 测方法特异性更强，结果更准确。世界粮农组织(FAO)已向许多国家推荐免疫检测技术。 因此 , 人们称免疫分析技术是 21 世纪最具竞争 性和挑战性的检测分析技术。1 免疫荧光技术在食品检测中的应用免疫荧光分析 (Immuno Fluorescence A

3、ssay,IFA ) 始创于 20 世 纪 40 年代初， 1942 年 Cons 等首次报道用异硫氰酸荧光素标记抗 体，检查小鼠组织切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗体， 但此种荧光素 标记物的性能较差，未能推广应用。 20 世纪 50 年代， Riggs 等合 成性能较为优良的异硫氰酸荧光素。 Mashall 等对荧光抗体的标记方 法又进行了改进，从而使得免疫荧光技术逐渐推广应用。1.1 底物标记荧光测定法 底物标记荧光测定法 (SLFIA) 使用一种 酶的底物标记待测物， 底物本身无荧光， 在受到相应酶的催化时能转 变为荧光物，当标记底物与抗体结合产生的空间位阻阻碍了酶与标记 底物间的接触，

4、样品中的待测物通过竞争作用使游离的酶标结合物或 荧光强度增加。1.2 荧光偏振免疫测定法 使用偏振光作为激发光时，视分子的运 动状态， 发射的荧光可能是振动方向随机化的普通荧光， 或是只在某 一平面振动的偏振荧光 (ploarized fluorescence) 。在反应液中，游 离的标记物分子体积小， 在布朗运动中转动速度快， 受偏振光照射后 产生的荧光偏振方向被分散，不能产生偏振光，只发射普通荧光；与 抗体结合的标记物分子体积增大， 布朗运动速度减慢， 甚至不能转动 而形成定向排列， 所以受偏振光激发后能产生偏振荧光， 样品中的待 测物的量越大，偏振荧光的强度越高 。1.3 荧光淬灭免疫测

5、定法 荧光淬灭免疫测定法 (Fluoresecent Que nchin gImmu noassay)的原理是当荧光标记物与抗体结合后发生荧 光淬灭。荧光猝灭的机制尚不清楚， 荧光淬灭可能与标记物与抗体结 合后导致电子振动状态的改变有关。1.4 荧 光 增 强 免 疫 测 定 法 荧 光 增 强 免 疫 测 定 法 (Fluoresecent EnhancementImmunoassay) 的原理与荧光淬灭增强免疫测定法相似，不同的是标记物与抗体结合后荧光强度增强。2 酶免疫检测技术在食品检测中的应用酶免疫检测技术是 20 世纪 60 年代在荧光和组织化学的基础上 发展起来的一种新技术， 最初

6、用酶代表荧光素标记抗体作为生物组织 中抗原的鉴定和定位。 随后发展为用于鉴定免疫扩散及免疫电泳板上 的沉淀线。到 1971 年， Engrall 等用碱性磷酸酶标记抗原或抗体， 建立了酶联免疫吸附试验 (ELISA) ，这一技术因其高度的准确性、特 异性、应用范围广、检测速度快以及费用低等优点，是目前食品检测 中令人瞩目的有发展前途的一种新技术。 酶免疫技术发展迅猛， 种类 繁多，酶免疫技术分为酶免疫组化技术和酶免疫测定技术， 酶免疫测 定技术又分为均相免疫测定技术和异相免疫测定技术， 异相免疫测定 技术又分为固相免疫测定技术和液相免疫测定技术 ELISA 技术把抗 原抗体特异性与酶反应的敏感

7、性相结合， 使食品在未经分离的提取的 情况下，即可进行定性和定量分析。近年来，该技术在食品安全检测 中正逐步推广应用，用于细菌及其毒素、真菌及其毒素、病毒、寄生 虫的检测， Lyer M. S. 和 CousinM. A. 等人研究用间接 ELISA 法来检 测食品和饲料中镰刀菌的灵敏度和特异性，可检测出102103cuf/mL 的含量。王彩云等应用酶联免疫方法测定奶粉中的黄曲霉毒素 M1， 多次实验重复测定结果的变异系数最大为 11.1 % , 实验的结果比较 精确, 重现性较好；总体平均回收率达 92.5 %。还用于蛋白质、激素、 农业残留、兽药残留和抗生素及食品成分和劣质食品的检测分析。

8、 1993 年, 王勇等建立了测定三唑酮的 ELISA 方法 , 应用于黄瓜、梨等食品的检测，其最低检出限为 40 ng/g, 回收率为92.44 %98.18 %,与用气相色谱检测的结果吻合。2006年，利用 ELISA 方法对尿样中的睾酮进行检测，合成睾酮抗原在羊体内 获得抗体，其抗稀释度可达 1:200000。尿样经二氯甲烷萃取、净化、 吹干、标准溶液的零样复溶后，进行 ELISA 检验，其灵敏度可达 12 pg/mL7 。 Frank 等采用不同连接臂的单环或双环半抗原分子与载体 蛋白连接分别制得免疫原 , 包被原和酶标抗原。 由双环抗原得到的抗 体所建立的ELISA方法对15种磺胺药

9、物的IC50低于100俱儿。 ELISA技术由于灵敏度高、特异性强、检测费用低和易于商品化，具 有十分广阔的应用前景。3 放射免疫技术在食品检测中的应用放射免疫技术(RadioImmunoassay, RIA)是以放射性核素为标记物 的标记免疫分析法。是由 Yalow 和 Berson 于 1960 年创建的标记 免疫分析技术。由于标记物放射性核素的检测灵敏性, 本法灵敏度高, 测定准确性良好,特别适应于蛋白质、激素和多肽的精确定量测定。 RIA 测定就是应用放射性物质代替 ELISA 中的标记酶作为抗原或抗 体耦联物，在食品安全检测中最常见的同位素是 3H和14CO1981年， 放射免疫分析

10、法 (RIA) 首先用于检测人的血液和莴苣叶片上的对硫磷 残留量，检测限为1020 ng/mL,检测水中的残留量可达4 ng/mL。 1978 年, Charm 在 RIA 技术的基础上发展了放射免疫检测技术 (RRA),放射免疫检测在快速检测方面最成功的是Charm II 6600/7600抗生素快速检测系统。 该系统就是利用专一受体来识别结合于同一类抗生素族中的母环以便最快速同时检测同一抗生素族在样品中的残 留情况。目前，CharmH 7600检测系统就B内酰胺类、氯霉素类、 四环素类、磺胺类、氨唑西林及碱性磷酸酶这六项检测以被FDA 认可。 1986 年， Evrard P. 等对牛尿提

11、取、浓缩后，利用放射免疫法 (RIA) 对其中残留的诺龙进行了检测，其灵敏度是 6 pg/mL， IC50 值为 59 pg/mL。通过对免疫原的设计，使得这种方法对其代谢产物19- NA、19- NE 等也有较高的交叉反应，具有较高的检出率。放射免疫技术 由于可以避免假阳性， 适宜于阳性率较低的大量样品检测， 对水产品、 肉类产品、 果疏产品中的农药残留量的检测中广泛应用。 还可检测经 食品传播的细菌及毒素、 真菌及毒素、 病毒和寄生虫及小分子物质和 大分子物质。如南京农业大学用放射免疫测定牛奶中的天花粉蛋白。4 免疫胶体金检测技术在食品检测中的应用 免疫胶体金检测技术又叫 Rosa.Tes

12、ts 法，是利用胶体金颗粒进行 标记的一项新技术。 该技术当前主要用于在牛奶中检测抗生素， 可在 10min 内快速检测牛奶中的抗生素， 利用该技术可检测的抗生素种类 有六种，B内酰胺、四环素、磺胺二甲嘧啶、恩诺沙星和黄曲霉毒 素，可检测的B-内酰胺药物有氨苄青霉素、阿莫西林、邻氯青霉素 头孢噻咲、头孢霉素和青霉素 G等。2006年，张明等将SMZ-OVA磺 胺甲噁唑-卵清白蛋白)固相化在检测带上检测SMZ该方法对SMZ标 准溶液的灵敏度达到50 ng/mL,整个检测反应在5 10 min内完成， 王喜亮等用胶体金标记磺胺嘧啶单克隆抗体作为显色剂， 磺胺嘧啶竞 争物包被于硝酸纤维素层析膜上作为

13、捕获试剂， 采用竞争反应模式制成胶体金免疫层析试纸对磺胺嘧啶残留的半定量检测。 读条系统判定 灵敏度为 5 ng/mL ，肉眼判定检测限灵敏度为 10 ng/mL ，与其它磺 胺类药物无交叉反应。该方法在不同动物源性食品 ( 鸡肉、鸡蛋、鸡 肝、猪肉、猪肝、牛奶、蜂蜜)中添加磺胺嘧啶的回收率在 68.11 % 118.18 %范围内，动物试验样品检测结果表明，该方法与 ELISA 及 HPLC具有好的符合率。免疫胶体金检测技术结果直观、操作简单， 在食品安全检测中有广阔的应用前景。5 单克隆抗体技术在食品检测中的应用1975 年， Kohler 和 Milstein 发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊

14、红 细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合， 形成了杂交细胞即可产生抗体， 又 可无限增殖， 从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。 这一技术为医学和 生物学基础研究开创了新纪元， 是免疫学领域的重大突破。 单克隆抗 体在食品检测中最大的优点是特异性强， 不易出现假阳性。 在食品检 测中有广泛的应用前景。 目前人们已制备出各种经食品传播和引起食 物中毒的细菌及毒素、真菌及毒素、病毒、寄生虫、农药、兽药、激 素等的单克隆抗体并建立的检测方法。Shirazid 等采用戊二醛，青霉素化反应等不同的免疫原合成方法，免疫小鼠， 筛选出单克隆抗体检测牛奶和畜产品中B -内酰胺类抗生素残留，最低检测限度为2.5 5 ng/

15、mL。吴建祥用与细胞色素C交联的氨苄青霉素(Amp- Cy) 免疫的 BALB/c 鼠脾细胞与 SP2/0 鼠骨髓瘤细胞融合，经筛选、克 隆，获得 3 株能稳定传代并分泌抗青霉素的单克隆抗体的杂交瘤细 胞(1C1, 2C11K和2G7)，间接竞争酶附试验(CI- ELISA)显示，3株 单克隆抗体对青霉素类和先锋霉素类抗生素有特异性反应， 而对链霉 素、卡那霉素、氯霉素、土霉素、四环素、新霉素其他抗生素没有交 叉反应，可用于青霉素类抗生素残留的检测。 磺胺二甲嘧啶和克伦特 罗（瘦肉精） 这两种药物被欧美各国和我国列为兽药残留控制重点， 国 内研究出了用于动物性食品中磺胺二甲嘧啶检测的单克隆抗体

16、试剂 盒和克伦特罗残留检测的多克隆试剂盒。这两种试剂盒具有特异性 强、仪器化程度低、样品前处理简单、检测时间短，在实际生产中应 用前景广阔，填补了国内空白。单克隆抗体检测技术可在 10 min 内 快速检测有机磷类、氨基甲酸酯类、有机氯类、拟除虫菊酯类及激素 类的残留量为农产品的优质安全提供技术支持。 英国建立了自动肉制 品中的沙门氏菌的单克隆抗体检测方。 法，人们还制出了单核增生性 李特氏杆菌的单抗，用单抗ELISA检测该菌。乳中氯霉素的单克隆抗 体检测技术也被建立。 食品储藏过程中会受到霉菌污染， 现已从青霉、 毛霉等霉菌中提取耐热性抗原制成单克隆抗体用 ELISA 方法可检出 加热和未加

17、热食品中的霉菌。6 免疫测定新技术6.1 脂质体免疫测定法 （LIA） 脂质体免疫测定法是一种较新的免疫测定技术，脂质体是由磷脂 或由其他类脂分子在水相中自发形成的一种密闭的双分子单层或多 层囊泡，脂质体表面还可以连接抗原或抗体分子。 这种生物模拟膜在 形成过程中能包裹水及其中的溶质 （ 染料或酶 ） ，膜的稳定性可随免 疫反应有规律变化。 根据释放出的标记物的量进行测定， 所以 LIA 具 有很高的信号放大作用。目前 LIA 主要存在脂质体的稳定性和非特异性溶解问题。6.2克隆酶给予体免疫测定法(CEDIA)克隆酶给予体 免疫测定法是一种新型均相免疫测定法。CEDIA 中使用由重组 DNA技

18、术获得的半乳糖苷酶两个独立的蛋白质片段， 这两个片段独立存在 时无酶活性， 但两个片段结合则显示催化活性。 以此作为分析方法的 基础。其中较小片段称为酶给予体片段(ED),另一片段称为酶受体片 段(EA)。ED标记物与抗体集合后不再与 EA形成酶，所以当样品中 待测物增加时则游离 ED 标记物增多，使反应液中酶产生增加，经底 物显色测定。CEDIA是目前灵敏度较高的均相免疫测定法。6.3 发光免疫测定法 (CLIA)发光免疫测定法常用鲁米诺 (Luminol) 、异鲁米诺 (Isolumi-nol) 及其衍生物进行标记。 这些环肼类化合物在碱性条件下可被氧化产生 3- 胺基苯二甲酸盐和 430 nm 的发射光。在鲁米诺的芳氨基上进行 烃链取代后产光性能增强， 但若置换芳氨基则发光被破坏。 另外丫叮 酯也用于发光标记。CLIA操作简单、灵敏度高、测定速度快。但CLI