天然的人源性核糖体展示抗体库的构建与初步鉴定

1、天然的人源性核糖体展示抗体库的构建与初步鉴定【摘要】目的构建库容量大、多样性好的核糖体展示单链抗体(scfv) 库,为进一步筛选scfv奠定基础。方法 从健康自愿者的外周血淋巴细胞 提取mrna,经rt pcr分别扩增抗体重链可变区(vh)和轻链可变区 (vl) dna,进而连接形成scfv dna。将其连接t vector转化e. coli jm109 大肠埃希菌，经蓝白筛选，挑取9个阳性克隆测序以鉴定scfv组装。通 过体外转录和翻译对抗体文库进行初步鉴定。结果vh、vl和scfv dna 分别约为350、650和1 100 bpo本试验成功构建scfv核糖体展示模板。 结论成功构建天然的

2、大容量核糖体展示人源性scfv文库,为下一步利用 亲和富集筛选技术获得各类scfv奠定基础。【关键词】抗体；单克隆；核糖体；埃希氏菌属；基因文库单链抗体(single chain fragment variant, scfv)是通过基因工程技 术方法把重链可变区(vh)、轻链可变区(vij连接而构建的重组蛋白，较之 完整抗体具冇分了量小、通透性高等特点，更适合用于药物靶向和免疫生 物治疗。构建scfv可通过传统的杂交瘤技术或噬菌体展示技术制备，而 近年来问世的核糖体展示技术(ribosomal display, rd)是一种不受细胞 转染和表达等因素影响的完全细胞外展示系统工程1,简化了 sc

3、fv的筛 选过程，可望筛选到高亲和力的scfvo本研究选川健康口愿者的外周血淋 巴细胞为材料，构建天然大容量核糖体展示scfv文库，为下一步筛选各类scfv奠定基础。1材料与方法1. 1材料和试剂 mrna提取试剂盒（瑞典amersham公司）；taq dna 聚合卿，t4 dna连接酶，兔网织红细胞裂解液，t7 rna聚合酶，rntps rnase inhibitor （美国 promega 公司）；pmd18 t vector 载体（口本 takara 公司）;rna抽提试剂盒（瑞士 roche公司）;脂多糖（lps,美国sigma aldrich集团公司）。1.2方法1. 2. 1 mr

4、na提取和rt pcr抽取10位健康志愿者外周血，其 屮男性5例，女性5例，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。按mrna提取 试剂盒（amersham）说明书所述步骤提取mrna。以oligo（dt）为引物逆转录 合成第一链cdna,具体方法按说明书进行。1. 2. 2 scfv dna的构建及扩增 利用mrna反转录合成cdna第1 链，以第1链为模板，扩增抗体基因按文献扩增人类主要的轻重链可变区 基因，所有引物序列根据抗体两端相对保守的框架区设计2 3。所需 引物和寡核廿酸均由上海生工负责合成。扩增重链vh可变区引物为：vh/t7 （上 游）：5gcagctaatacgactcactatagg

5、aacagaccaccatgaggtsmarctgcagsagtcwgg 3，vh2 （下游）：5' tgaggagacggtgaccgtggtcccttggcccc 3'其中划线部分为t7启动子序列；黑体部分所示为核糖体结合位点。扩增vl可变区引物为:vl （上游）：5'attgagctcacccagtctcca3'ck （下游）：5gaacactcattcctgttggagct 3'引物中的简并碱基符号m二a/c, r二a/g, s二c/g, w二a/t,扌赛呈序1 （30个 循环：94 °c xi min55 °cx2 min7

6、2 °cx2 min）进行 pcr,分别扩增 vh和vl cdna，对扩增产物进行纯化并测定其浓度。linker序列为 （gly4ser）3,该引物两端的各18个碱基分别与vh和vl基因的3端和5' 端相互补。将vh、vl和linker等量混合后，经程序2 （7个循环：94 °c x 1 min63 °cx4 min）进行聚合反应使vh和vl籍linker dna连接形成 scfv dnao然后通过引物vh2和ck进行pcr扩增，执行程序1,使聚合的 scfv dna得到扩增。1.2.3核糖体展示抗体库的构建 将最后纯化的核糖体scfv展示 模板连接t v

7、ector,用bio rad电转化仪将连接产物转化入ecoli jm109, 通过蓝白筛选，随机挑収9个克隆子，进行菌落pcr法验证。将验证阳性 的克隆子测序，分析序列，以此评价文库序列的多样性。1.2.4核糖体展示抗体库的初步鉴定 将pcr扩增的随机scfv dna文库进行离体转录（终浓度/100 ul：lx转录bufffer>10 imnol/l dtt、 100 u rnase inhibitor、0. 75 mmol/l rntps. 40 u t7 rna 聚合酶、2 u g随机dna文库），37 °c反应2 h,回收mrnao转录产物再用兔网织红细 胞裂解液系统进行

8、离体翻译（50 hl的体积加入兔网织红细胞裂解液35 » l、1 mmol/l不含亮氨酸的氨基酸复合物05 u l> 1 mmol/l不含甲硫 氨酸的氨基酸复合物0. 5 ul、40u rnase抑制剂10 u l、mrna 2 n g） 30 °c培育30 min,于冰上放置。将体外翻译完成的产物立即从30 °c拿出，加入冰冷的pbsmb溶液, 轻轻混匀后，加入已用lps封闭好预冷的酶联板中，每孔50 ul,冰上放 置12 ho用pbstm （1 xpbst缓冲液中含5 mmol/l mgc12）冲洗3遍， 每次5 min,然后用pbsm （1xpbs缓冲

9、液中含5 mmol/l mgc12）冲洗2 遍，每次5 mino加入eb缓冲液（1xpbs缓冲液中含20 mmol/l edta）, 冰上放置10 min,吸取上清。重复此步骤1次。将收集的上清用rna抽提 试剂盒（roche）提取上清中的rna,引物vh/t7和ck反转录扩增rna得到 一轮筛选后的scw dna文库。将dna文库又进行体外转录、翻译、筛选, 重复2次。得到3次筛选后的scfv dna文库。分别以回收的rna为模板 进行rt pcro2结果2. 1 vh、vl及scfv dna的扩增结果 扩增得到的vii和vl dna 分别约为350 bp和650 bp, vh、vl和lin

10、ker连接后的scfv片段大小为 1. 1 kb左右。将大量扩增的scfv dna通过琼脂糖凝胶电泳回收纯化，保 存于-20 °c （图1）。2.2核糖体展示scfv文库的构建及分析 将菌落pcr验证为阳性 的9个克隆子测序。结果表明，克隆的9条scfv序列都是完整的，为开 放阅读框，内部没有终止密码子。通过v base dnaplot软件分析9条 scfv序列，其重链分别属于vh1, vh3, vh5, vh4基因家簇，轻链分别属 于vki, vkii, vkiii亚基因家簇。根据kabat软件分析，9条序列的重链 和轻链cdrs （互补决定区）也均有不同程度的变化。2.3核糖体展

11、示scfv文库的初步鉴定 将每轮回收得到的rna各 取2 »l进行rt pcr扩增，扩增结果见图2。从图屮可以看出，第一轮 筛选后回收的mrma进行rt pcr扩增，得到一条非常微弱的条带。而经 过3轮筛选后，得到非常明亮的扩增条带。3讨论rd是蛋白质筛选的重要工具，己用于筛选配体、受体，确定抗原表 位，开发新的蛋白酶抑制物和新的药物等。该技术的特点是：正确折叠的 完全蛋白和编码它的inrna,同时结合在核糖体上，利用抗原抗体特异性结 合的特点，便于蛋白富集，便于抗体文库筛选，是种无细胞系统的蛋白 质改造技术，可分为真核和原核rd。真核系统较原核系统冇一定的优越性, 原核系统受内源r

12、nase的影响较大，生成的mrna容易降解，而真核系统 受内源rnase的影响较小。另外真核系统有利于提高某些蛋口质的翻译和 折叠效率4。因此在本研究中笔者采用真核rd。核糖体展示完全在体外 进行，弥补了噬菌体展示、细菌表面展示、酵母表面展示)等细胞内展示 的不足，显著增强了库容量及分子多样性，库容量可以达到1013-1015, 比噬菌体展示文库(约109)提高了 104106倍5。冇研究表明合理的scfv应有一个连接vh和vl的柔性序列，通常 是(gly4ser)3,而且vh和vl两功能域的排序应是vh在上游，vl在下游。 否则，scfv不仅活性极差，而且难于诱导免疫应答6。鉴于此，笔者所

13、构建的scfv也按上述顺序排列。互补决定区(cdrs)在抗原抗体特异性结 合方面起着重要作用，cdrs的多样化意味着不同抗原特异性多样化。从实 验结果口以看!11,所构建的scfv dna文库序列是完整而多样的，口于进一步进行特异性抗原的筛选。在木实验中，以lps作为抗原进行了三联 复合体的筛选。经过3轮筛选后扩增得到的dna条带明显比只经过一轮筛 选后扩增的dna条带强，说明在rd过程中，能与lps特异性抗原相结合 的scfv基因得到了显著的富集。表明构建的核糖体展示文库是成功的， 为进一步的scfv筛选奠定了坚实的基础。【参考文献】1 christian z, patrick a, and

14、reas p ribosome display selecting and evoiving proteins in vitro that specifical 1 y bind to a targetj. nature methods, 2007 (4) :269279.2 黄开红，李学先，陈茵婷，等.大容量核糖体展示抗体库的构建与初步鉴定j中国实用内科杂志,2007, 27 (18) :14651469.3 吴红艳，章晓联，潘勤.利用核糖体展示文库初步筛选与伤寒杆菌iv型纤毛结合的细胞受体j生物技术通讯，2004, 15 (4) :319322.4 levin a m, weiss g a. optimizing the affinity and specificit