高效液相色谱法123

1、HPLCHPLC与经典与经典LC区别区别一、柱内展宽一、柱内展宽uCCCuBAHssmm)(/Csm为静态流动相传质阻力系数为静态流动相传质阻力系数组分在色谱柱中运行时间不同，导致色谱组分在色谱柱中运行时间不同，导致色谱峰展宽。峰展宽。影响因素：固定相的粒度和填充均匀程度影响因素：固定相的粒度和填充均匀程度1. 涡涡 流流 扩散扩散 项项 A减少方法减少方法 ： a 降低降低dp：目前商品柱多采用目前商品柱多采用3-5m粒径粒径 b 降低降低：采用球形、均匀分布固定相。采用球形、均匀分布固定相。B=2Dm Dm T/ 2. 2. 纵纵 向向 扩扩 散散 项项 B/uB/u样品分子沿流动相方向产

2、生扩散，所引起样品分子沿流动相方向产生扩散，所引起峰展宽峰展宽u是最佳流速的是最佳流速的3-5倍倍B/u忽略忽略液相色谱中液相色谱中Dm比比GC中小中小1053.3.流动的流动相传质阻力项流动的流动相传质阻力项C Cmmu u流动相本身，处于不流动相本身，处于不同层流的分子具有不同层流的分子具有不同流速。同流速。mpmDdC/2Dm T/减免方法：减免方法：1）减少固定相颗粒直径）减少固定相颗粒直径 2）减少流动相液体黏度（甲醇）减少流动相液体黏度（甲醇）4. 4. 静态流动相传质阻力项静态流动相传质阻力项C Csmsmu u原因：处于固定相颗粒原因：处于固定相颗粒内部孔洞内静态流动相内部孔洞

3、内静态流动相引起引起影响影响C Csmsmu u的因素与的因素与C Cm m相同相同5. 5. 固定相的传质阻力项固定相的传质阻力项C Cs su u影响因素：固定相内部阻力影响影响因素：固定相内部阻力影响 sfmDdC/2减免方法：减少固定相液膜厚度减免方法：减少固定相液膜厚度化学键合相化学键合相 H = A + （Cm+Csm）u1. 固定相与装柱方法的选择：固定相与装柱方法的选择： 选粒径小的、分布均匀的球形固定相（选粒径小的、分布均匀的球形固定相（dp10m） 首选化学键合相，匀浆法装首选化学键合相，匀浆法装柱柱二、柱二、柱 外外 展展 宽宽减免方法：应尽可能减少柱外死体积减免方法：应

4、尽可能减少柱外死体积从进样器到检测器之间的体积称柱外死从进样器到检测器之间的体积称柱外死体积，均可导致色谱展宽，柱效下降。体积，均可导致色谱展宽，柱效下降。第第3 3节节 各类高效液相色谱法各类高效液相色谱法吸附色谱法吸附色谱法化学键合相化学键合相离子对色谱法离子对色谱法2固定相：极性和非极性固定相固定相：极性和非极性固定相3流动相：底剂（烷烃）流动相：底剂（烷烃）+ 有机极性调节剂有机极性调节剂 二、二、 化学键合相色谱法化学键合相色谱法（bonded phase chromatography, BPCbonded phase chromatography, BPC）化学键合相：采用化学反应

5、的方法化学键合相：采用化学反应的方法 将固将固定液的官能团键合在载体表面上。定液的官能团键合在载体表面上。优点：固定相不易流失优点：固定相不易流失 适用于各种样品的分离分析适用于各种样品的分离分析 正相键合相色谱法正相键合相色谱法：极性键合相，如氨基柱、氰基柱极性键合相，如氨基柱、氰基柱适用：极性化合物适用：极性化合物 反相键合相色谱法：反相键合相色谱法：非极性键合相，如非极性键合相，如C18柱、柱、C8柱柱适用：非极性至中等极性化合物适用：非极性至中等极性化合物分分 类类1 1、反相键合相色谱法（、反相键合相色谱法（RP-HPLCRP-HPLC）反相键合相色谱法（反相键合相色谱法（RP-HP

6、LC）SiOH+SiClR2R1C18H37SiOR2R1C18H37Si+HCl低碳型低碳型： R R1 1、R R2 2都是氯都是氯高碳型高碳型：R R1 1、R R2 2是两个甲基是两个甲基 特点：载样量大，保留能力强特点：载样量大，保留能力强键键 合合 相相 分分 类类中碳型中碳型：R R1 1、R R2 2其中一个是氢，一个为氯其中一个是氢，一个为氯表面覆盖度表面覆盖度：参加反应的硅醇基数目，：参加反应的硅醇基数目，占硅胶表面硅醇基总数的比例。占硅胶表面硅醇基总数的比例。作用：作用：决定了键合相是分配还是吸附占决定了键合相是分配还是吸附占主导主导封尾封尾：为了减少残余的硅醇基，一般在

7、：为了减少残余的硅醇基，一般在键合反应后，用三甲基氯硅烷等小分子键合反应后，用三甲基氯硅烷等小分子进行钝化处理。进行钝化处理。3）流动相：）流动相：极性大的甲醇极性大的甲醇-水或乙腈水或乙腈-水水 流动相极性流动相极性 固定相极性固定相极性 底剂底剂 + 有机调节剂（极性调节剂）有机调节剂（极性调节剂） 例：水例：水 + 甲醇，乙腈，四氢呋喃甲醇，乙腈，四氢呋喃 反相键合相色谱法（反相键合相色谱法（RP-HPLC）反相键合相色谱法（反相键合相色谱法（RP-HPLC）用用ODSODS柱分离苯、甲苯，流动相为甲醇柱分离苯、甲苯，流动相为甲醇- -水水（9595：5 5）问：问：哪个先出柱哪个先出柱

8、若要增大若要增大t tR R，应增大甲醇还是水的比例，应增大甲醇还是水的比例? ?例：例：2 2、正相键合相色谱法（、正相键合相色谱法（NP-HPLCNP-HPLC）正相键合相色谱法（正相键合相色谱法（NP-HPLCNP-HPLC）6）适用）适用：氰基键合相：与硅胶的柱选择性相似氰基键合相：与硅胶的柱选择性相似氨基键合相：糖类等氨基键合相：糖类等Phenomenex Luna C18（250mm4.6mm，5 m）色谱柱色谱柱 (Aschaffenburg, Germany)。流动相：。流动相：(A)乙腈乙腈-(B)0.3%醋酸水溶液进行梯度洗脱：醋酸水溶液进行梯度洗脱：0-30min：A 2

9、8%，B 72%； 30-53min： A 28升至升至34，B 72降至降至66；53-70min： A 34升至升至80，B 66降至降至20。流速：流速：1.0 mlmin-1；检测波长：检测波长：275 nm；进样量：进样量：20l；柱温：柱温：30；min010203040506070mAU020 DAD1 E, Sig=275,16 Ref=off (F:DONNAAJXJX0-66JIANG035.D)Lunamin010203040506070mAU01020 DAD1 E, Sig=275,16 Ref=off (F:DONNAAJXJX0-66JIANG050.D)Krom

10、asilmin010203040506070mAU 050100 VWD1 A, Wavelength=275 nm (F:DONNAAJXJX0-66JIANG051.D)Zobax Eclipsemin010203040506070mAU0255075 DAD1 E, Sig=275,16 Ref=off (F:DONNAAJXJX0-66JIANG054.D)Zobax Extendmin010203040506070mAU050100 DAD1 E, Sig=275,16 Ref=off (F:DONNAAJXJX0-66JIANG057.D)Zobax SB流动相的性质和选择流动相的

11、性质和选择1、流动相的物理性质、流动相的物理性质 1)流动相要求：流动相要求：易得易纯化，无毒不易燃。易得易纯化，无毒不易燃。检测器的适应性检测器的适应性:如如紫外紫外检测器对检测器对溶剂的透明波长要求；溶剂的透明波长要求；示差折光示差折光不能不能用梯度洗脱用梯度洗脱对样品有一定溶解度而不反应对样品有一定溶解度而不反应纯净纯净,低廉低廉,低粘度低粘度(510-4Pa.S),低沸点低沸点(柱温柱温(2050) 2)流动相的流动相的物理性质物理性质沸点沸点bp、分子量、分子量M、密度、介电常数、密度、介电常数e粘度粘度、折射率、折射率RI、紫外吸收截止波长、紫外吸收截止波长溶剂强度参数溶剂强度参数

12、(Al2O3)、溶解度参数溶解度参数(色散色散d、取向极性、取向极性0、受质子、受质子a给质子给质子h)、溶剂极性参数溶剂极性参数P/ (质子接质子接受受xe、给质子、给质子xd、偶极、偶极xn)、选择性分选择性分组组、表面张力、表面张力、离子对色谱溶剂强度离子对色谱溶剂强度(P/+0.25e) 常用于常用于HPLC流动相溶剂的性质流动相溶剂的性质溶剂的强度因素溶剂的强度因素,P/规定：戊烷在规定：戊烷在Al2O3的的=0(硅胶硅胶)=(Al2O3)0.77 混合溶剂混合溶剂 ?BBABBBAABnNnN.)1 ()(.10.lg0000N摩尔分数摩尔分数;nB为吸附剂吸一个为吸附剂吸一个B分

13、子所占面积分子所占面积,吸附剂吸附剂活性。一般活性。一般0.61.0, nB=4-6随随B分子体积而变化分子体积而变化 0：液：液-固色谱中溶剂强度参数，反固色谱中溶剂强度参数，反映溶剂分子对吸附剂亲和力。映溶剂分子对吸附剂亲和力。经验：经验：0减小减小0.05，k值增加值增加13倍倍溶解度参数溶解度参数mcVEEC是是1mol气体变液体释放能量气体变液体释放能量;Vm液体摩尔体积液体摩尔体积 =色散色散+偶极偶极+接受质子接受质子+给出质子给出质子极性参数极性参数P/ 硝基甲烷二氧六烷乙醇)lg()lg()lg(/gggKKKpKg为极性分配系数为极性分配系数P:液液-液色谱溶剂极性参数，表

14、示溶液色谱溶剂极性参数，表示溶剂洗脱强度和溶剂的选择性剂洗脱强度和溶剂的选择性经验：经验：P改变改变2单位，单位，k值改变值改变10倍倍极性参数极性参数P与溶剂强度参数关系与溶剂强度参数关系投影投影粘度参数粘度参数注意注意:溶剂常用溶剂常用0.4-0.5mPa.s,太大柱太大柱效下降效下降,大小易成气泡大小易成气泡,混合时一般粘混合时一般粘度变化非线性度变化非线性 1 2 3 4水0B1001.正丙醇2.乙醇3.甲醇4.乙腈2、溶剂的选择性与分类、溶剂的选择性与分类(Snyder)K与分子之间作用力？与分子之间作用力？色散力、偶极力、氢键力色散力、偶极力、氢键力参考物的选择参考物的选择 (Sn

15、yder法法) 强偶极作用强偶极作用-硝基甲烷硝基甲烷-Xn质子给予体质子给予体-乙醇乙醇-Xd质子接受体质子接受体-二氧六环二氧六环-Xe参考物与被检溶剂间作用力关系表参考物与被检溶剂间作用力关系表/)log(pKxge乙醇表表2 Snyder的溶剂选择性分组的溶剂选择性分组 混合溶剂混合溶剂P/：?/iiPP注注:模糊聚类法模糊聚类法 把溶剂对质子给予体、质子接受体、电把溶剂对质子给予体、质子接受体、电子给予体、电子接受体和定向作用力化子给予体、电子接受体和定向作用力化合物的选择性五个参数进行分类，选择合物的选择性五个参数进行分类，选择21种常用溶剂种常用溶剂 表表 混合溶剂的溶剂特性混合

16、溶剂的溶剂特性举例：举例：在反相色谱中，计算甲醇在反相色谱中，计算甲醇-水水(60:40)的溶剂溶剂强度，如果改用的溶剂溶剂强度，如果改用相同强度的乙腈相同强度的乙腈-水溶剂，四氢呋喃水溶剂，四氢呋喃和水其比例是多少？和水其比例是多少？解：查表得甲醇、乙腈、四氢呋喃和解：查表得甲醇、乙腈、四氢呋喃和水的溶剂强度水的溶剂强度S分别为分别为2.6,3.2,4.5,0 甲醇甲醇-水：水：S=0.602.6+0.400=1.56乙腈乙腈-水水 S=X3.2+(1-X)0=1.56 X=0.49 THF-水水 S=X4.5+(1-Y)0=1.56 Y=0.35 2)选择一般原则选择一般原则 正相键合相正

17、相键合相 反相键合相反相键合相主体溶剂主体溶剂 正已烷正已烷(正庚烷、正戊烷正庚烷、正戊烷) 水水选择性溶剂选择性溶剂 a.质子接受体质子接受体 乙醚或甲基叔丁基醚乙醚或甲基叔丁基醚 甲醇甲醇*b.质子给予体质子给予体 氯仿氯仿 乙腈乙腈*c.偶极偶极 二氯甲烷二氯甲烷 四氢呋喃四氢呋喃*3溶剂优化的步骤：溶剂优化的步骤：1.首选择溶剂2.多元溶剂系统组成3.洗脱能力的选择(,P/,S)调k重点组分k=(t-t0)/t0 34.改变溶剂系统改变选择性5.混合溶剂优化6.PH缓冲剂、胺、配合物、添加剂离子强度调节剂7.组分性质差别大可用梯度洗脱如如:四面体四面体-三角形法三角形法1选择乙腈选择乙

18、腈-水水,2.比例比例100%往下调节确定往下调节确定k值而得最值而得最适合的比例适合的比例.图图9-293.改变溶剂改变溶剂:甲醇-水;THF-水比例计算找等洗脱强度三角形图图9-304.混合溶剂混合溶剂:三元、四元三元、四元图图9-335.七种溶剂流动相色谱分析七种溶剂流动相色谱分析图图9-344、色谱分离条件的优化指标、色谱分离条件的优化指标1)色谱响应系数色谱响应系数niLMittPPCRF10)(ln其中其中:P=f/g,n相邻峰对数相邻峰对数;tM最大最大容许时间容许时间,tL实际时间，实际时间，常数常数2)色谱优化函数色谱优化函数 niLMidiittRRACOF1)(lnAi权重因子权重因子,R分离度分离度COF绝对值越大越差绝对值越大越差 举例举例取代萘混合物分离的优化试验取代萘混合物分离的优化试验色谱柱：色谱柱：Zorbax-C8（1500.46