10制剂处方及工艺(peg-uox)

1、注射用聚乙二醇化尿酸氧化酶 申报资料项目No.10治疗用生物制品第一类 临床研究申报资料No.10注射用聚乙二醇化尿酸氧化酶制剂处方及工艺的研究资料 起草负责人：刘沐荣起草单位：修正生物医药（杭州）研究院有限公司起草参加人：刘沐荣 张加慧起草时间：2016年11月联系人：刘翔联系地址：杭州市滨江区滨文路95号活水工业园4号楼2层联系方式TelFax）邮政编码：310052申报单位：修正生物医药（杭州）研究院有限公司（盖 章）目 录一、制剂处方11、处 方12、使用方法23、处方依据23.1、冻干制剂的优势23.2、冻干工艺过程33.3

2、、冻干制品中的保护剂及其作用44、处方筛选54.1、国外同类产品制剂处方54.2、辅料选择54.3、处方研究5二、制剂工艺51、工艺流程52、工艺说明63、制备工艺63.1、磷酸缓冲液配置63.2、配液63.3、过 滤63.4、分装及加塞63.5、冷冻干燥6三、辅料来源及质量标准6四、保存及有效期7五、文献资料7六、附件9一、制剂处方 1、处 方注射用聚乙二醇化尿酸氧化酶是一种白色或类白色的疏松冻干无菌制剂，不含任何防腐剂。每支制剂含比活性大于2 EAU/mg的PEG-UOX蛋白5 mg和一定量的赋形剂、保护剂、缓冲剂等辅料。每支冻干制剂的具体组成如下：聚乙二醇化尿酸氧化酶5 mg甘露醇30

3、mg甘氨酸50 mg十二水合磷酸氢二钠13.6 mg二水合磷酸二氢钠0.33 mg用注射用水溶解后pH为8.0。2、使用方法使用前每支制剂用2.0mL无菌注射用水溶解，稀释于输液用生理盐水（0.9% NaCl溶液），通过静脉滴注给药。3、处方依据3.1、冻干制剂的优势聚乙二醇化尿酸氧化酶是一种蛋白酶，其等电点pI 6.0，在pH4.09.0溶液中蛋白酶不容易长久地保持酶活性，因此选择冻干粉针作为聚乙二醇化尿酸氧化酶的制剂。聚乙二醇化尿酸氧化酶经冷冻干燥后抑制了水的活动，制品内所有的化学反应都趋于零，物质基本可以保持在不消耗状态，因而可以长期保存。冷冻干燥是指把蛋白溶液在低温下冻结，然后在真空条

4、件下升华干燥，除去冰晶，待升华结束后再进行解吸干燥，除去部分结合水的干燥方法。该过程主要可分为：分装、预冻、一次干燥（升华干燥）、二次干燥（解吸干燥）和密封保存等五个步骤。蛋白质酶类样品按上述方法冻干后，可在4避光长期贮存，需要使用时，加注射用水或生理盐水溶解，即可恢复到冻干前的状态。与其它剂型相比，冷冻干燥法具有非常突出的优点和特点：a) 药液在冻结前分装，剂量准确；b) 在低温下干燥，能使被干燥药品中的热敏物质保留下来，能够保持药物成分的生物活性。温度较低也避免整个过程微生物的污染，能较好地保持药物原来的性状；c) 在低压下干燥，被干燥药品不易氧化变质，同时因缺氧而灭菌或抑制某些细菌的活力

5、；d) 冻结时被干燥药品可形成“骨架”，干燥后能保持原形，形成多孔结构而且颜色基本不变；e) 干燥后的制品疏松多孔，呈海绵状，复水性好，冻干药品可迅速吸水还原成冻干前的状态；f) 脱水彻底，通常冻干药品的水分含量低于或接近于2%，最高不超过3%。适合长途运输和长期保存。3.2、冻干工艺过程为保证冻结干燥后的制品具有一定的形状，原液溶质浓度应该在4%25%之间，以10%15%最佳。制品在容器中成型一般制品分装厚度不宜超过15mm。根据制品的特点，先确定以下3个数据后才能设计最优的冻干工艺方案。共熔点温度：药物的液体混合物预冻后发生熔化时的相转变温度。崩解温度：冻干制品升华到一定时候，制品会出现上

6、层的干燥层和下层的冻结层，二层间交界面就形成一个升华面，随升华的进行而下降。此时，已干燥的制品是疏松多孔的状态，一定程度上封闭了下层冻结制品水蒸气的逸出通路，升华速率变漫，从冻结制品吸收升华热也随之减少。此时，导热搁板层供给的热量将有多余，引起冻结制品的温度上升，当温度升高到共熔点以上时，制品就会发生融化或发泡现象，影响冻干制品的质量，通常将制品会发生融化或发泡现象叫做制品发生了崩解。发生崩解时的温度叫做该制品的崩解温度。混合物质的崩解温度，取决于各组分的崩解温度，因此在选择制品的冻干保护剂时，应选择具有较高崩解温度的材料，使升华干燥能在不很低的温度下进行。玻璃化转变温度：冻干制品中保护剂取代

7、了水，蛋白质表面形成了一层假定的水化膜，蛋白质表面的氢键不直接暴露在周围环境中，稳定了蛋白质结构。这种结构黏度增大，分子扩散系数极低，物质兼有固体和液体的行为，形成了碳水化合物玻璃体。蛋白质大分子在这样的结构中链锻运动受阻，三级结构得到稳定。如果温度升高，分子运动加速，玻璃态结构遭到破坏，相转变发生，蛋白质结构改变，生物学活性受到影响，这一温度就是玻璃化转变温度。预冻的最低温度应适当低于制品的共熔点1015即可（一般生物药品的预冻温度控制在-30-40之间即可）。冷冻结实后再抽真空进入干燥程序。冻干过程中必须对制品提供足够的热量。但要注意为制品提供热量有一定限度。不能使制品温度超过制品自身的共

8、熔点温度。在温度尚不到升华所必需的低温时，不能抽真空。否则，没有完全冻结的浓缩液体会产生“沸腾”。在干燥工艺设计时，应注意的另一个温度称为崩解温度（塌陷温度），如果温度高于塌陷温度，样品就会局部出现“塌方”现象。但在实际过程中塌陷温度很难准确测到，因此常以最低共熔点做为参考。在冻干过程中，箱体内的压力应控制在一定的压力范围内。箱体内压力低虽有利于制品内冰的升华，但压力低于10Pa时，气体的对流传热小到可以忽略不计。就生物药品而言，理想的压力控制范围应在2040Pa 之间。二级干燥在共熔点和崩解温度以下，应尽量提高制品的温度，一级干燥阶段结束后，制品的温度已达到0以上，90%左右的水分都已经去除

9、。在此阶段将搁板温度设置在40左右，并保持恒定一般效果不错。实验证明干燥箱体内压力在1030Pa之间较为合适。在二级干燥过程中，制品温度达到最高许可温度，并保持2个小时以上。在冻干机的运行过程中，将搁板温度、制品温度与系统真空度随时间的变化真实地记录下来，即可得到制品的冻干曲线。冻干曲线是进行冷冻干燥过程控制的基本依据。典型的冻干曲线中导热搁板的升温过程分为两个阶段。在升华的阶段搁板保持较低温度，根据制品的实际情况可控制在不超过最低共熔点的较高温度。在第二阶段依制品理化性质将搁板温度适当调高到不超过玻璃化转变温度的较高温度。3.3、冻干制品中的保护剂及其作用冷冻干燥是一个多步骤过程，会产生多种

10、应力使样品变性，如低温应力、冻结应力和干燥应力。为了保护药品的活性，通常在药品配方中添加活性物质的保护剂。它需要具备四个特性：玻璃化转变温度高、吸水性差、结晶率低和不含还原基。常用的保护剂有如下几类物质：a) 糖类/多元醇：蔗糖、海藻糖、甘露醇、乳糖、葡萄糖、麦芽糖等；b) 聚合物：HES、PVP、PEG、葡聚糖、白蛋白等；c) 无水溶剂：乙烯乙二醇、甘油、DMSO、DMF等；d) 表面活性剂：Tween 80等； e) 氨基酸：L-丝氨酸、谷氨酸钠、丙氨酸、甘氨酸、肌氨酸等；f) 盐和胺：磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐等； 糖是最常见、使用最广泛的一类冻干保护剂，是蛋白质非特异性稳定剂，在冻干的各

11、个阶段均能对蛋白质药物起到一定的保护作用。双糖是研究最多也是公认最有效的保护剂，其中蔗糖化学性质稳定，多呈无定型结构，对防止蛋白质二级结构改变、冻干处理过程中及贮藏期内蛋白质的伸展和聚集起显著作用。氨基酸是常见的蛋白质保护剂，在冷冻过程中，低浓度的甘氨酸可通过抑制磷酸盐缓冲液所致pH值的改变而阻止蛋白质药物变性。结晶型甘氨酸能升高成品的塌陷温度，防止因塌陷而引起的蛋白质药物的破坏。吐温80等一些表面活性剂有时对冷冻干燥过程中的蛋白质起到一定的保护作用。在某些冻干制品中假如盐或胺可获得特定的蛋白质稳定效果。联合使用不同类型的保护剂可获得稳定性更佳的冻干制品。4、处方筛选4.1、国外同类产品制剂处

12、方国外已上市产品Krystexxa制剂为注射液，Krystexxa是一种无色透明的无菌磷酸盐缓冲生理盐水溶液，其中每支含有8 mg/ml 聚乙二醇化尿酸氧化酶。每支包装含聚乙二醇化尿酸氧化酶8mg、二水合磷酸氢二钠（Na2HPO42H2O）2.18mg，氯化钠(NaCl) 8.77mg，二水合磷酸二氢钠(NaH2PO42H2O) 0.43mg。该处方要求样品2到8(36到46)冷藏保存，要避光保存，不要摇晃或冷冻。保存条件要求较高，有必要筛选新的处方以降低保存难度。4.2、辅料选择美国FDA网站公开了一些已上市的聚乙二醇化蛋白药物的制剂处方，见文献参考资料。根据这些处方初

13、步设计了3个处方，并对样品的稳定性进行了初步分析，-20样品室温化冻后考察，冻干粉复溶后考察，结果见表10-1。（部分空白处为未做相关实验或相关数据缺失）表10-1 处方筛选的初步考察处方组成保存条件检测考察时间（天）059PEG-UOX5 mg/mL甘氨酸20mg/mLPB40mmol/LpH8.0溶液4电泳无降解无降解有降解活性4.073.753.42外观澄清澄清澄清溶液-20电泳活性外观冻干粉4电泳活性外观PEG-UOX5 mg/mL丙氨酸20mg/mLPB40mmol/LpH8.0溶液4电泳无降解无降解有降解活性4.443.993.26外观澄清澄清澄清溶液-20电泳活性外观冻干粉4电泳

14、活性外观PEG-UOX5 mg/mL甘氨酸20mg/mL甘露醇15mg/mLpH8.0溶液4电泳无降解无降解无降解活性3.473.463.34外观澄清澄清澄清溶液-20电泳无降解无降解无降解活性3.473.303.43外观澄清澄清澄清冻干粉4电泳无降解无降解无降解活性外观澄清澄清澄清PEG-UOX5 mg/mL甘氨酸20mg/mL蔗糖15mg/mLpH8.0溶液4电泳无降解无降解有降解活性4.033.223.54外观澄清澄清澄清溶液-20电泳活性外观冻干粉4电泳活性外观根据上述初步试验结果选择甘露醇、甘氨酸、磷酸缓冲液组成制剂处方，配制不同浓度的辅料冻干后考察外观（未进行系统考察）。当甘露醇浓

15、度为15mg/mL、甘氨酸25mg/mL、PB为40mmol/L时，外观呈完整的“Cake”状，可依此结果进行进一步筛选。4.3、处方研究处方样品浓度冻干、处方稳定性，25度、4度相关数据缺少。综合处方的稳定性考察和制剂规格，确定了注射用聚乙二醇化尿酸氧化酶的处方组成为（以1000mL计）： 聚乙二醇化尿酸氧化酶2500 mg甘露醇15000 mg甘氨酸25000 mg十二水合磷酸氢二钠13600 mg二水合磷酸二氢钠330 mg 配制上述处方的注射用聚乙二醇化尿酸氧化酶半成品并冻干制成制剂，分别测定半成品的最低共熔点和制剂的玻璃化转变温度Tg，结果见图（半成品的最低共熔点和制剂的玻璃化转变温

16、度实验未做，结果无。）制剂液体药物混合物半成品的最低共熔点为，从开始，相转变已经开始，在冻干的第一阶段，温度不能长时间超过，以避免发生共熔现象和塌陷，这样才能使制剂具有很好的外观和保持蛋白样品的稳定性。制剂的玻璃化转变温度为，但玻璃化转变在时已经开始，这一结果要求冻干第二阶段样品温度不能长时间超过，而且样品长时间保存也不宜超过这个温度。二、制剂工艺1、工艺流程原 液分装及加塞过滤除菌配 料压 盖冷冻干燥贴标签成 品扎铝盖2、工艺说明聚乙二醇化尿酸氧化酶是蛋白质，其空间结构和酶活性易受环境条件的影响而改变，因此整个制剂制备过程应控制环境条件及所有溶液和容器的温度，温和操作，并采用0.22m滤膜无

17、菌过滤后分装并冷冻干燥。干燥完毕，先压好内盖再出箱，以保证冻干制剂的水分含量合格。3、制备工艺3.1、磷酸缓冲液配置精密称取十二水合磷酸氢二钠13.6g，二水合磷酸二氢钠0.33g，加注射用水定容至1000mL，测定pH值为8.0±0.2。3.2、配液根据处方及原液所含聚乙二醇化尿酸氧化酶的蛋白浓度，按1000mL量计准确算出所需的原液的体积，再算出需补加的甘氨酸、甘露醇、磷酸盐储液的量，并准确称量，加适量注射用水充分混匀后，然后缓慢加至2500mg聚乙二醇化尿酸氧化酶原液中并混匀，补加注射用水至1000mL（辅料及溶媒均预冷至410）, 调pH8.0。最终聚乙二醇化尿酸氧化酶的蛋白

18、浓度为2.5mg/mL，PB为40mmol/L。3.3、过 滤用0.22m滤膜无菌过滤，检查澄明度。3.4、分装及加塞按每支1.0mL灌装，并盖塞。3.5、冷冻干燥（样品冻干曲线缺少）分装好的半成品放入冻干机后设置搁板温度为-40使样品温度迅速降低，样品冻结。在样品温度降到接近-40时升高搁板温度开始第一个阶段的冻干。两个小时内样品温度变化情况（无图）。从图中可看出样品温度降低过程中在时温度升高，这是由于液态样品在降温过程中达到最低共融点时的放热过程导致样品温度升高。因此在冻干过程的第一阶段有大量水分存在的条件下样品温度不能超过最低共融点，以防止发生相变引起样品结构发生变化。在这一条件下样品温

19、度越高，冻干速度越快。热分析表明样品在升温过程中时就开始发生相转变。将第一阶段搁板温度设为可使样品温度保持在左右。第一步干燥控制搁板温度为左右，干燥小时，第二步干燥控制搁板温度为，使样品温度低于，干燥小时左右结束冻干。 3.6、压内盖，出箱无菌条件下压盖，扎铝盖后即得成品。以上操作均在局部100级条件下进行。3.7、加外盖3.8、贴标签、装盒核对品名、规格、批号后，贴签并装盒。三、辅料来源及质量标准聚乙二醇化尿酸氧化酶原液：本公司自行研制，质量符合注射用聚乙二醇化尿酸氧化酶中试产品制造和检定规程（草案）的要求。甘氨酸：药用级，符合中国药典2015版标准。甘露醇：药用级，符合中国药典 2015版

20、标准。磷酸氢二钠：中国生物制品主要原辅材料质控标准，年版。磷酸二氢钠：中国生物制品主要原辅材料质控标准，年版。注射用水：符合中国药典 2015版标准。质量标准见附件四。四、保存及有效期28保存，有效期两年（暂定）。五、文献资料1、孙东坡，胡一桥，蛋白质冷冻干燥制品中的保护剂及其保护机制 药学进展，Vol.27 No.4, 2003；2、陈光明，蛋白质药品冷冻干燥技术研究进展；3、李 津、俞 霆、董德祥 主编，生物制药设备和分离纯化技术，化学工业出版社，2003年；4、梅兴国 主编，生物技术药物制剂基础与应用，化学工业出版社，2004年；5、FDA批准的部分聚乙二醇修饰生物制品的处方，见表10-

21、5；原文见附件。编号名称成分含量备注1KRYSTEXXA(pegloticase)pegloticase8mg/mL注射液二水合磷酸氢二钠12.2mmol/L二水合磷酸二氢钠2.8mmol/L氯化钠150mmol/L2CIMZIA(certolizumab pegol)certolizumab pegol200mg/mL冻干粉蔗糖乳酸吐温certolizumab pegol200mg/mL预充式注射器醋酸钠氯化钠注射用水3Mirceramethoxy polyethylene glycol-epoetin beta磷酸钠硫酸钠甘露醇蛋氨酸泊洛沙姆1884Neulasta(pegfilgrastim)pegfilgrastim10mg/mL（蛋白含量）预充式注射器醋酸10mmol/L山梨糖醇50mg/mL吐温-200.03mg/mL钠离子10mmol/L注射用水pH 4.05 Oncaspar(pegaspargase)6ADAGEN(pegademase