仪器分析光谱分析法导论

1、广东医学院分析中心仪器分析光谱分析法导论1第第2章章 光谱分析法引论光谱分析法引论主要内容（了解）：主要内容（了解）： 光学分析法与光谱分析法的定义光学分析法与光谱分析法的定义 光谱分析法的分类：分子光谱、原子光谱光谱分析法的分类：分子光谱、原子光谱 发射光谱、吸收光谱发射光谱、吸收光谱 光谱仪器的结构：光谱仪器的结构： 光源、单色器、吸收池光源、单色器、吸收池 检测器、显示系统检测器、显示系统 光学分析法（光学分析法（optical analysis）: :根据根据物质物质发射的电磁辐射发射的电磁辐射或或电磁辐射与物质相互作用电磁辐射与物质相互作用而建立而建立起来的一类仪器分析方法。起来的一

2、类仪器分析方法。能源提供能量能源提供能量能量与被测物相互作用能量与被测物相互作用产生被检测信号产生被检测信号光学分析法三个主要过程光学分析法三个主要过程广东医学院分析中心仪器分析光谱分析法导论4电磁辐射与物质相互作用的方式有吸收、发射反射、电磁辐射与物质相互作用的方式有吸收、发射反射、折射、散射、干涉、衍射、偏振等。折射、散射、干涉、衍射、偏振等。常见电磁辐射与物质作用的术语常见电磁辐射与物质作用的术语 吸收吸收：原子、分子或离子吸收光子的能量，从：原子、分子或离子吸收光子的能量，从基态跃迁至激发态的过程。基态跃迁至激发态的过程。 发射发射：物质从激发态跃迁回基态，并以光的形：物质从激发态跃迁

3、回基态，并以光的形式释放出能量的过程。式释放出能量的过程。 散射散射：光通过介质时，光子与介质分子之间发：光通过介质时，光子与介质分子之间发生碰撞，导致光子运动方向改变。生碰撞，导致光子运动方向改变。 折射和反射折射和反射:当光从介质当光从介质1照射到与介质照射到与介质2的界面时，一部分的界面时，一部分光在界面上改变方向返回介质光在界面上改变方向返回介质1，称为光的反射；另一部分，称为光的反射；另一部分光则改变方向，以一定的折射角度进入介质光则改变方向，以一定的折射角度进入介质2，称光的折射。，称光的折射。 干涉干涉：在一定条件下光波相互作用，当其叠加：在一定条件下光波相互作用，当其叠加时，将

4、产生一个其强度视各波的相位而定的加强时，将产生一个其强度视各波的相位而定的加强或减弱的合成波。或减弱的合成波。 衍射衍射：光波绕过障碍物或通过狭缝时，以约：光波绕过障碍物或通过狭缝时，以约180 的角度向外辐射，波前进的方向发生弯曲。的角度向外辐射，波前进的方向发生弯曲。2.1 2.1 光学分析法及其分类光学分析法及其分类(P67) 由于各区电磁辐射能量不同，与物质相互作用由于各区电磁辐射能量不同，与物质相互作用的机制不同，因此所产生的物理现象亦不同，由此的机制不同，因此所产生的物理现象亦不同，由此可建立各种不同的光学分析法。可建立各种不同的光学分析法。广东医学院分析中心仪器分析光谱分析法导论

5、9光学分析法的分类光学分析法的分类v光谱分析法光谱分析法：基于：基于物质的光谱物质的光谱建立起来的分析建立起来的分析方法。测量物质与辐射能作用时，物质内部发方法。测量物质与辐射能作用时，物质内部发生量子化的能级跃迁而产生的吸收、发射或散生量子化的能级跃迁而产生的吸收、发射或散射辐射的波长和强度。射辐射的波长和强度。v非光谱法：基于物质与辐射相互作用时，测量非光谱法：基于物质与辐射相互作用时，测量辐射的某些性质，如折射、干涉、衍射等变化辐射的某些性质，如折射、干涉、衍射等变化的分析方法。不涉及物质内部的能级跃迁。的分析方法。不涉及物质内部的能级跃迁。 光谱（光谱（物质的光谱物质的光谱）：当物质与

6、辐射能相互作用，）：当物质与辐射能相互作用，物质内部发生能级跃迁，记录由能级跃迁所产生物质内部发生能级跃迁，记录由能级跃迁所产生的辐射能强度随波长的变化，所得图谱为光谱的辐射能强度随波长的变化，所得图谱为光谱（spectrum）。光学分析法光学分析法非光谱法非光谱法光谱法光谱法分子光谱分子光谱原子光谱原子光谱吸收光谱吸收光谱发射光谱发射光谱散射光谱散射光谱一、一、分子光谱法分子光谱法和和原子光谱法原子光谱法分子光谱法是由分子光谱法是由分子中分子中电子能级电子能级以及以及振动和转振动和转动能级动能级的变化产生的，表现形式为的变化产生的，表现形式为带光谱带光谱 分析方法有：分析方法有：UV-Vis

7、、IR、MFS、MPS原子光谱法是以测量原子光谱法是以测量气态气态原子或离子外层或内原子或离子外层或内层电子层电子能级跃迁所产生能级跃迁所产生的原子光谱为基础的成的原子光谱为基础的成分分析法，它的表现形式为分分析法，它的表现形式为线光谱线光谱。 分析方法有：分析方法有：AES、AAS，AFS、XFS 3691215200 220 260 280 320 340nm原子光谱为线状光谱分子光谱与原子光谱分子光谱与原子光谱分子光谱为带状光谱广东医学院分析中心仪器分析光谱分析法导论15二、发射光谱法和吸收光谱法二、发射光谱法和吸收光谱法物质的原子光谱与分子光谱，按其获得物质的原子光谱与分子光谱，按其获

8、得的方式不同可分为发射光谱和吸收光谱。的方式不同可分为发射光谱和吸收光谱。（一）发射光谱法（一）发射光谱法 物质通过激发过程获得能量，变为激发态原物质通过激发过程获得能量，变为激发态原子或分子子或分子M M* * ，当从激发态过渡到低能态或基态时，当从激发态过渡到低能态或基态时以辐射的方式释放能量，产生发射光谱。以辐射的方式释放能量，产生发射光谱。 M M* * M + M + hv hv 通过通过测量物质发射光谱的波长和强度测量物质发射光谱的波长和强度进行定性和进行定性和定量分析。定量分析。1. 1. 射线光谱法射线光谱法 天然或人工放射性物质的天然或人工放射性物质的原子核在衰变原子核在衰变

9、的过程中的过程中发射发射 和和 粒子后，使自身的核激发，然后核通过粒子后，使自身的核激发，然后核通过发射发射 射线回到基态。测量这种特征射线回到基态。测量这种特征 射线的能量射线的能量（或波长），可以进行定性分析，测量（或波长），可以进行定性分析，测量 射线的强射线的强度（检测器每分钟的记数），可以进行定量分析。度（检测器每分钟的记数），可以进行定量分析。广东医学院分析中心仪器分析光谱分析法导论18r r计数器计数器广东医学院分析中心仪器分析光谱分析法导论19液体闪烁计数器（计数器）广东医学院分析中心仪器分析光谱分析法导论20放射测定法在医学检验中的应用例子：放射测定法在医学检验中的应用例子：

10、v放射免疫测定法：激素及代谢产物 肾上腺素（E）、 去甲肾上腺素（NE） 甲状腺激素（T3T4） 蛋白质和肽类激素（催产素、生长激素）v放射测定法：菌血症、菌尿症诊断、菌种鉴定、分枝杆菌快速培养及抗菌素敏感试验 2. 2. X X射线荧光分析法射线荧光分析法 原子受高能辐射激发，其原子受高能辐射激发，其内层电子能级跃内层电子能级跃迁迁，即发射出特征，即发射出特征X X射线，称为射线，称为X X射线荧光。用射线荧光。用X X射线管发生的一次射线管发生的一次X X射线来激发射线来激发X X射线荧光是最射线荧光是最常用的方法。测量常用的方法。测量X X射线的能量（或波长）可以射线的能量（或波长）可以

11、进行定性分析，测量其强度可以进行定量分析。进行定性分析，测量其强度可以进行定量分析。X X射线荧光光谱仪射线荧光光谱仪3. 3. 原子发射光谱分析法（原子发射光谱分析法（AESAES） 用火焰、电弧、等离子炬等作为激发源，用火焰、电弧、等离子炬等作为激发源，使使气态气态原子或离子的外层电子原子或离子的外层电子受激发受激发发射特征发射特征光谱。波长范围在光谱。波长范围在190 900nm。广东医学院分析中心仪器分析光谱分析法导论24AESAES在医学检验中应用在医学检验中应用v血液电解质：Na、K、Ca、Cl、P、Cu、Zn、Mg、Fe .广东医学院分析中心仪器分析光谱分析法导论25等离子体发射

12、光谱仪 (ICP)4. 4. 原子荧光分析法原子荧光分析法 气态自由原子吸收特征波长的辐射能后，气态自由原子吸收特征波长的辐射能后，原原子的外层电子子的外层电子 从基态或低能态跃迁到较高能态，从基态或低能态跃迁到较高能态，约经约经1010-8-8 s s，又跃迁回基态或低能态，同时发射出又跃迁回基态或低能态，同时发射出与原激发波长相同（共振荧光）或不同的辐射。与原激发波长相同（共振荧光）或不同的辐射。 波长在紫外和可见光区。在与激发光源成一波长在紫外和可见光区。在与激发光源成一定角度（通常为定角度（通常为9090 ）的方向测量荧光的强度，可）的方向测量荧光的强度，可以进行定量分析。以进行定量分

13、析。广东医学院分析中心仪器分析光谱分析法导论27原子荧光光谱仪光路图原子荧光光谱仪光路图5. 5. 分子荧光分析法分子荧光分析法 某些物质被紫外光照射后，某些物质被紫外光照射后，物质分子物质分子吸收辐吸收辐射能而成为激发态分子，然后在回到基态的过程射能而成为激发态分子，然后在回到基态的过程中发射出比激发光波长更长的荧光。中发射出比激发光波长更长的荧光。 测量荧光的强度可作高灵敏度定量分析。荧测量荧光的强度可作高灵敏度定量分析。荧光波长在紫外光波长在紫外- -可见光谱区。可见光谱区。广东医学院分析中心仪器分析光谱分析法导论296. 6. 分子磷光分析法分子磷光分析法 物质吸收光能后，基态分子中的

14、一个电子被激物质吸收光能后，基态分子中的一个电子被激发跃迁至第一激发单重态轨道，由第一激发单重发跃迁至第一激发单重态轨道，由第一激发单重态的最低能级，经系统间交叉跃迁至第一激发三态的最低能级，经系统间交叉跃迁至第一激发三重态（系间窜跃），并经过振动弛豫至最低振动重态（系间窜跃），并经过振动弛豫至最低振动能级，由此激发态跃迁回至基态时，便发射磷光。能级，由此激发态跃迁回至基态时，便发射磷光。原子发射光谱与原子荧光、分子荧光和分子磷原子发射光谱与原子荧光、分子荧光和分子磷光光谱的区别：光光谱的区别：同样是发射光谱，但后三种方法是以辐射能同样是发射光谱，但后三种方法是以辐射能（一次辐射）作为（一次辐

15、射）作为激发源激发源，然后再以辐射跃迁，然后再以辐射跃迁（二次辐射）的形式返回基态。（二次辐射）的形式返回基态。7. 7. 化学发光分析法化学发光分析法 由由化学反应化学反应 提供足够的能量，使其中一种反提供足够的能量，使其中一种反应物分子的电子被激发，形成激发态分子。激发应物分子的电子被激发，形成激发态分子。激发态分子跃迁回基态时，发出一定波长的光。其发态分子跃迁回基态时，发出一定波长的光。其发光强度随时间变化。在合适的条件下，峰值与被光强度随时间变化。在合适的条件下，峰值与被分析物浓度成线形关系，可用于定量分析。分析物浓度成线形关系，可用于定量分析。 由于化学发光反应类型不同，发射光谱范围

16、为由于化学发光反应类型不同，发射光谱范围为400 1400nm。广东医学院分析中心仪器分析光谱分析法导论33 当物质所吸收的电磁辐射能与该物质的原当物质所吸收的电磁辐射能与该物质的原子核、原子或分子的两个能级间跃迁所需的能子核、原子或分子的两个能级间跃迁所需的能量满足量满足E = E = hv hv 的关系时，将产生吸收光谱。的关系时，将产生吸收光谱。根据物质对不同波长辐射能的吸收，建立各种根据物质对不同波长辐射能的吸收，建立各种吸收光谱法。吸收光谱法。 吸收光谱吸收光谱： M + M + hvhv M M* * 发射光谱发射光谱： M M* * M + M + hvhv（二）吸收光谱法（二）

17、吸收光谱法1.1.MssbauerMssbauer（莫斯鲍尔）谱法莫斯鲍尔）谱法 由与被测元素相同的同位素作为由与被测元素相同的同位素作为 射线的发射射线的发射源，使吸收体（样品）原子核产生源，使吸收体（样品）原子核产生 无反冲的无反冲的 射射线共振吸收线共振吸收 所形成的光谱。光谱波长在所形成的光谱。光谱波长在 射线区。射线区。 从从MssbauerMssbauer谱可获得原子的氧化态和化学键、谱可获得原子的氧化态和化学键、原子核周围电子云分布或邻近环境电荷分布的不原子核周围电子云分布或邻近环境电荷分布的不对称性以及原子核处的有效磁场等信息。对称性以及原子核处的有效磁场等信息。2.2.原子吸

18、收光谱法原子吸收光谱法 利用待测元素利用待测元素气态原子气态原子对共振线的吸收进行定量对共振线的吸收进行定量测定的方法。其吸收机理是测定的方法。其吸收机理是原子的外层电子能级跃迁原子的外层电子能级跃迁，波长在紫外、可见和近红外区。波长在紫外、可见和近红外区。原子吸收分光光度计原子吸收分光光度计 3.3.紫外紫外- -可见分光光度法可见分光光度法 利用溶液中的分子或离子在紫外和可见利用溶液中的分子或离子在紫外和可见光区产生光区产生分子外层电子能级跃迁分子外层电子能级跃迁所形成的吸收所形成的吸收光谱，进行定性和定量测定的方法。光谱，进行定性和定量测定的方法。 波长范围波长范围200200800nm

19、800nmUv3101Uv3101紫外紫外- -可见分光光度计可见分光光度计广东医学院分析中心仪器分析光谱分析法导论40UV-VISUV-VIS在医学检验中的应用在医学检验中的应用v血红蛋白测定：氰化高铁血红蛋白（HiCN）测定法：540nmv十二烷基硫酸钠血红蛋白（SDS-Hb）测定法：538nm、540nmv尿液蛋白质检测：丽春红-S法：560nm 考马斯亮兰法：600nmv尿糖检测：葡萄糖氧化酶比色法：500nm 4. 4.红外光谱法红外光谱法 利用分子在红外光区的振动利用分子在红外光区的振动- -转动吸收光谱转动吸收光谱来对物质进行定性鉴别和结构分析的方法。来对物质进行定性鉴别和结构分

20、析的方法。 波长范围在波长范围在2.52.52525m mFT-IR5. 5. 核磁共振波谱法核磁共振波谱法 在强磁场作用下，在强磁场作用下，一些原子核产生核自旋能级一些原子核产生核自旋能级分裂分裂，当用一定频率的射频照射分子时，可引起，当用一定频率的射频照射分子时，可引起原子核自旋能级的跃迁，吸收一定频率的射频，原子核自旋能级的跃迁，吸收一定频率的射频，产生核磁共振（产生核磁共振（NMR）。）。以核磁共振信号强度对照射频率（或磁场强度）以核磁共振信号强度对照射频率（或磁场强度）作图，即为核磁共振波谱。利用该方法可进行作图，即为核磁共振波谱。利用该方法可进行结构测定、定性及定量分析。结构测定、

21、定性及定量分析。广东医学院分析中心仪器分析光谱分析法导论44（三）（三）RamanRaman散射光谱散射光谱 频率为频率为 0 0 的单色光通过透明介质，在透射和反的单色光通过透明介质，在透射和反射方向以外出现的光称散射光。如果这种散射是光射方向以外出现的光称散射光。如果这种散射是光子与物质分子发生能量交换引起，即不仅光子的运子与物质分子发生能量交换引起，即不仅光子的运动方向发生变化，它的能量也发生变化，则称为动方向发生变化，它的能量也发生变化，则称为RamanRaman散射。散射。 Raman Raman散射光的频率（散射光的频率（m m）与入射光的频率不同，与入射光的频率不同，称为称为Ra

22、manRaman位移。位移。RamanRaman位移的大小与分子的振动和位移的大小与分子的振动和转动的能级有关，利用转动的能级有关，利用RamanRaman位移研究物质结构的位移研究物质结构的方法称为方法称为RamanRaman光谱法。光谱法。广东医学院分析中心仪器分析光谱分析法导论462.3 2.3 电磁辐射的性质电磁辐射的性质v在在“第三章第三章 紫外紫外-可见分光光度法可见分光光度法”中再介绍中再介绍2.3 2.3 光谱仪器光谱仪器(P-9)(P-9) 用来研究吸收、发射或荧光的电磁辐射强度用来研究吸收、发射或荧光的电磁辐射强度和波长关系的仪器叫做光谱仪或分光光度计。和波长关系的仪器叫做

23、光谱仪或分光光度计。 光谱仪一般包括五个基本单元：光源、单色光谱仪一般包括五个基本单元：光源、单色器、样品容器、检测器和读出器件。器、样品容器、检测器和读出器件。 广东医学院分析中心仪器分析光谱分析法导论48 光源是提供足够的能量使试样蒸发、原子光源是提供足够的能量使试样蒸发、原子化、激发，产生发射光谱。化、激发，产生发射光谱。发射光谱仪结构示意图发射光谱仪结构示意图 吸收光谱仪结构示意图吸收光谱仪结构示意图 由光源和单色器得到的待测组分的共振吸收波长，由光源和单色器得到的待测组分的共振吸收波长，通过吸收池，被样品待测组分吸收，再被检测器接通过吸收池，被样品待测组分吸收，再被检测器接收，即可测

24、得其吸收信号。收，即可测得其吸收信号。 ex: 激发光波长激发光波长 em: 荧光发射波长荧光发射波长光光源源样品样品发射光发射光单色器单色器检测器检测器读出器件读出器件 荧光光谱仪示意图荧光光谱仪示意图单色器单色器激发光激发光exem 一、光源一、光源 要求：足够的输出功率（光强度）和稳定性。要求：足够的输出功率（光强度）和稳定性。 光源有连续光源和线光源等。光源有连续光源和线光源等。 连续光源：分子吸收光谱法连续光源：分子吸收光谱法 线光源：原子吸收和线光源：原子吸收和RamanRaman光谱法。光谱法。仪器主要部件仪器主要部件1. 1. 连续光源连续光源 连续光源是指在波长范围内发射强度

25、平稳的连续光源是指在波长范围内发射强度平稳的具有连续光谱的光源。具有连续光谱的光源。（1 1）紫外光源）紫外光源 氢灯氢灯或或氘灯氘灯：光谱范围为：光谱范围为160375 nm。 氘灯的工作方式与氢灯相同，光谱强度比氢灯氘灯的工作方式与氢灯相同，光谱强度比氢灯 大大3 5倍，寿命也比氢灯长。倍，寿命也比氢灯长。（2 2）可见光源）可见光源 钨丝灯：波长范围为钨丝灯：波长范围为320 2500nm 氙灯：波长范围氙灯：波长范围250 700nm。光谱强度大光谱强度大（3 3）红外光源红外光源 能斯特灯、硅碳棒，通过电加热方式产生能斯特灯、硅碳棒，通过电加热方式产生 连续辐射。连续辐射。 2. 2

26、. 线光源线光源（1 1）金属蒸气灯）金属蒸气灯 汞灯：波长范围汞灯：波长范围254 734nm 钠灯：波长钠灯：波长589.0nm、589.6nm（2 2）空心阴极灯（）空心阴极灯（HCLHCL） 主要用于原子吸收光谱，能提供许多元素的特征光谱。主要用于原子吸收光谱，能提供许多元素的特征光谱。（3 3）激光）激光 激光的强度高，方向性和单色性好，作为一种新型激光的强度高，方向性和单色性好，作为一种新型光源应用于光源应用于RamanRaman光谱、荧光光谱、发射光谱、光谱、荧光光谱、发射光谱、fourier r变换红外光谱等领域。变换红外光谱等领域。二、单色器二、单色器 作用：将复合光分解成单

27、色光或有一定宽度的谱带作用：将复合光分解成单色光或有一定宽度的谱带 组成：入射狭缝和出射狭缝、准直镜、色散元件组成：入射狭缝和出射狭缝、准直镜、色散元件 （如棱镜或光栅）（如棱镜或光栅）广东医学院分析中心仪器分析光谱分析法导论57 中阶梯光栅分光系统中阶梯光栅分光系统1. 1. 棱镜棱镜 原理：由于不同波长的光在同一介质中具有不原理：由于不同波长的光在同一介质中具有不同的折射率，波长短的光折射率大，波长长的光折同的折射率，波长短的光折射率大，波长长的光折射率小。因此，平行光经色散后按波长顺序分解为射率小。因此，平行光经色散后按波长顺序分解为不同波长的光，经聚焦后在焦面的不同位置成像，不同波长的光，经聚焦后在焦面的不同位置成像，得到按波长展开的光谱。得到按波长展开的光谱。 2. 2.光栅光栅 光栅分为透射光栅和反射