植物组织培养：玉米遗传转化方法及其研究进展

1、玉米遗传转化方法及其研究进展摘要 随着植物转基因技术的深入发展,大豆、玉米、油菜和棉花等转基因作物大面积商品化生产为全球的粮食安全做出了巨大贡献。近年来，玉米的转基因技术发展迅速,农艺性状改良涉及抗除草剂、抗虫、抗病、抗旱、抗盐和品质改良等，其中抗除草剂和抗虫玉米已成为主要的商业化转基因作物。本文综述了玉米遗传转化的几种常用方法且对其利弊进行讨论，玉米转基因技术的研究进展及应用，展望了玉米转基因研究的发展方向。 关键词 玉米；遗传转化方法；转基因技术；应用 玉米是重要的粮食、饲料，同时也是现代工业的重要原料。随着畜牧业、工业的 发展以及世界人口的增长，玉米在农业生产中占有越来越重要的地位。19

2、98年 以来，玉米已超过水稻和小麦成为全球第一大作物1。建国以来，我国玉米播种 面积、单产和总产量都呈持续增长趋势，但与美国等玉米生产大国还存在较大差 距。玉米总需求的断攀升使得玉米生产面临巨大挑战。自1988年Rhodes等2首次获得玉米转基因完整植株以来，玉米遗传转化技术得到了较大的发展，不但许多有价值的基因转入玉米 , 而且转基因方法也出现了多样化：基因枪法、农杆菌介导法、花粉管通道法等。随着转基因技术的完善与发展，更多的优良外源基因将被用于玉米的遗传改良，并且为阐述单子叶植物基因表达调控机理提供了新方法。而且，随着研究的深入，在降低转化受体依赖性、提高转化效率、提出新型转化方法等方面取

3、得了重要的进展。 1 玉米遗传转化方法 1.1 电激法 电激法转化外源基因是用短时、高脉冲电处理细胞，使细胞膜出现可恢复性孔隙，从而产生新的渗透点(3-4 nm)，为外源DNA进入细胞提供了通路。电激法不受宿主限制，可以用于原生质体、愈伤组织、胚性悬浮细胞系、幼胚等，操作简单，但转化效率低，在玉米遗传转化技术研究初期应用较为广泛。 1 1.2 花粉管通道法 花粉管通道法是在植物整体水平进行目的基因DNA片段的导入，直接获得转化种子，通过后代的筛选获得带有目的基因的片段。由于其利用自身的生殖系统作为载体，被众多研究者采用。花粉管通道法无基因型限制且易实现大规模基因转化，而且不需要昂贵的仪器设备和

4、组织培养技术，但是产生变异后代的类型特别丰富，因此对后代的检测比较繁琐。 1.3 PEG法 1993年,Golovkin等3用PEG法将H89的原生质体分别与含有CaMV35S启动子和鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)突变基因( 氨甲喋呤抗性 )的质粒 pMP和pDMP共培养,其中pDMP的mdhfr基因插入了玉米 Ds1 转座子，用氨甲喋呤筛选得到抗性愈伤组织，在不含激素的培养基上再生出植株。Omirulleh等4 用PEG法将外源基因导入到由HE8的悬浮细胞系分离得到的原生质体，建立了植株再生的转化体系。PEG法转化效率较高，但必须以裸露的原生质体为受体，而且还受到基因型的限制。 1.4 基因枪

5、法 基因枪法又称微粒枪法、微粒轰击法(gene 2 gun,particlegun,particlebombard 2 ment)，是依赖高速度的金属微粒将外源基因引入活细胞的一种转化技术。它利用高速运动的金属粒子，可以非特异地将外源基因导入植物的细胞、组织和器官，不再受到受体基因型的限制，又能避开原生质体再生的障碍，为玉米遗传转化掀开了新的一页。 1.5 农杆菌介导法 农杆菌作为一种天然的植物基因转化系统，具有转化的外源DNA结构完整、转化机理清楚、整合位点较稳定、拷贝数低、整合后的外源基因结构变异较小等优点，因而倍受重视。国际上近年来将注意力转向农杆菌介导的单子叶植物基因转化方法的研究，并

6、取得了明显的进展。Gould等(1991)5用 gus报告基因和Npt基因通过农杆菌介导法转化玉米Funk G90的芽尖，得到的再生植株及其子一代基因组中带有标记基因，从而为建立玉米高效遗传转化体系奠定了基础。Ishida等(1996)6建立了一套农杆菌介导的高效转化体系，通过对菌株、菌液浓度、幼胚等各种因素的优化，使玉米的转化效率达到了30%,成为玉米遗传转化进程中的一个里程碑。 2 玉米转基因应用现状1996-2009年全球转基因玉米种植面积占全球转基因作物总面积的百分比稳定增长(图2)。目前，转基因玉米农艺性状改良主要涉及抗除草剂、抗虫、抗病、 抗旱和品质改良等，商业化种植面积较多的是抗

7、除草剂、抗虫和二者复合性状转基因玉米(表1)毫无疑问，转基因技术在玉米生产中将发挥越来越重要的作用。 图2 全球转基因玉米面积占转基因作物面积百分比 产品2007 年2008 年抗虫930710抗除草剂700570抗虫 / 抗除草剂18802450合计35103730表1 全球转基因玉性状种植概况7 万hm2 2.1 抗除草剂转基因玉米 抗除草剂转基因玉米是高效、低成本控制杂草的新途径。目前，国内已经利用转基因技术获得具有潜在利用价值的抗除草剂转基因玉米新材料，其抗除草剂基因主要来源于细菌等微生物。 2.2 抗虫转基因玉米 抗虫转基因玉米能克服农药带来的不利因素如：(1)玉米中有农药残留；(2

8、)害虫逐步产生抗药性；(3)化学农药作用方式是非特异性的，杀死害虫的同时也使其天敌受害，从而危及多种生物资源8。目前，来源于微生物的抗虫基因是目前商业化应用最有效基因之一。近年来，研究人员在尝试克隆植物来源的抗虫转基因代替微生物来源基因。 2.3 抗病转基因玉米 玉米生长期间常受到病毒性病害(矮花叶病、玉米粗缩病等)、真菌性病害(玉米纹枯病)和细菌性病害等侵袭而使其品质及产量下降。常规育种由于抗原的缺乏和不同物种间的遗传隔离，使抗病育种工作受到了极大的限制，而研究抗病转基因玉米可以为玉米抗病育种提供新的种质。挖掘新的抗病基因，利用转基因技术实现多抗病基因的聚合转化，培育多抗玉米材料将成为玉米抗

9、病分子育种的发展趋势。 2.4 抗旱、耐盐转基因玉米 我国水资源紧缺，干旱和半干旱耕地面积多，还有大片的盐渍土壤，因此，培育抗旱、耐盐转基因玉米新品种对提高作物的单位面积产量和扩大种植区域尤为重要。目前，孟山都公司宣布其研究开发的抗旱转基因玉米已经进入实用阶段，预计将于2010年以后投入市场。 2.5 改良玉米品质 随着人们生活水平的不断提高和膳食结构的改变，玉米品质改良显得尤为重要。因此，利用转基因技术将外源基因或人工合成的高蛋白基因导入玉米来改良玉米的营养品质将成为研究热点。 2.6 其他应用 玉米转基因研究还涉及雄性不育和生物反应器等方面。 3 玉米转基因研究存在的问题及展望 3.1 多

10、基因转化和基因聚合 玉米转基因研究的下一个目标是发展更有效的技术以高效地转移并同时表达多个外源基因。有研究表明，通过农杆菌介导法成功地将相关外源基因 (psy,lcy,crtI)整合到水稻基因组中，培育出胚乳中富含-胡萝卜素的转基因水稻品种，食用后可满足人体每天所需VA,由于其稲米外观颜色为黄色，也被称为黄金米9。发展玉米多基因转化和基因聚合技术改良玉米品质，使其具有复合性状是今后玉米分子育种的明显特点。 3.2 选择标记的安全性 玉米转基因载体常采用选择标记基因如抗生素或除草剂抗性基因，表达上述标记基因的转化细胞对相应的抗生素或除草剂产生抗性，但这些化学筛选剂会抑制转化细胞的生长和再生而降低

11、转化率。近年来这些选择标记基因对生态系统和人类健康的影响已引起公众的关注。鉴于这些因素,培育无选择标记的转基因玉米植株已成为重要目标。从转基因玉米植株中剔除选择标记基因或无选择标记基因转化是目前获得无选择标记转基因植株的主要策略。 3.3 基因打靶或基因定点重组技术 基因定点重组技术是20世纪80年代后兴起的建立在基因同源重组技术和胚胎干细胞技术基础上的一种分子生物学技术10。所谓基因打靶技术是将携带有选择标记的外源目的基因采用一定的方法导入受体细胞，再通过外源DNA序列与受体细胞染色体上同源DNA序列间发生重组，最终将外源DNA定点整合到受体细胞基因组某一确定的位点，或对某一预先确定的受体位

12、点进行定点突变，导致受体细胞基因功能敲除或者点突变发生的技术11。 3.4 叶绿体转化技术 4 结语及讨论目前,利用基因枪转化技术获得的抗虫和抗除草剂的转基因玉米已经应用于玉米的商业化生产,农杆菌介导法建立的转化体系也越来越成熟。基因枪法不受受体基因型的限制,能避开原生质体再生的障碍,但其价格比较昂贵,并且得到较多的多拷贝转基因植株;而农杆菌介导法可转移相对较大的DNA片段,获得较多的单拷贝转基因植株,转化效率高,但对有壁细胞或组织的转化效果较差。有学者将基因枪和农杆菌介导这两种技术结合,取长补短。Hansen等(1996)12创建了农杆枪法(Agrolistic)。与此同时，由于玉米转基因育

13、种涉及多个环节,发达国家及其相应公司已致力于发展规模化转基因玉米平台,实现了工厂化的运作模式,开展了大规模基因功能鉴定和遗传转化。目前,我国正通过转基因新品种培育重大专项整合国内大部分科研院所的资源,来加快玉米转基因研究步伐,争取缩小与美国等发达国家在该领域内的差距。另外，外国农业生物技术公司掌握了大量的基因及技术专利,因此，我国必须在重大项目实施过程中掌握一批拥有自主知识产权的功能基因，保护我国的生物技术产业。随着我国玉米种植面积的稳步上升及需求量的扩大，转基因玉米研究将越来越受到全球化的挑战。参考文献1 张世煌，徐伟平，李明顺，等。玉米育种面临的机遇和挑战。玉米科学，2008,16(6):

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