PCR法突变体质粒构建

1、PCRPCR法法突变质粒构建突变质粒构建 PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点标准的标准的PCRPCR反应体系反应体系4种dNTP混合物 各200umol/L引物 各10100pmol模板DNA 0. .12ugTaq DNA聚合酶 2. .5uMg2+ 1. .5mmol/L1234522557294时间（min）温度（）PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点

2、1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点9550引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第1轮结束95第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点955072TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件PCR

3、过程PCR的特点72第2轮结束PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点灵敏度高1.皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平2. 能从100万个细胞中检出一个靶细胞3.病毒检测的灵敏度可达3个RFU4.细菌检测的最小检出率为3个细菌简便、快速1.一次性加好反应液，24 小时完成扩增2.扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低u血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA3PCR的类型和应用 研究基因克隆，DNA测序，分析突变 诊断

4、细菌、病毒、寄生虫检测，诊断 人类基因组工程遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱 法医犯罪现场标本分析 肿瘤各种肿瘤检测 其他3实验原理实验原理双酶切双酶切连接实验原理Xho I/BamH IXho I/BamH I引物引物1和和4分别带分别带有有Xho I/BamH I转化大肠杆菌DH5 Amp平板筛选无菌落挑取单菌落扩增质粒实验原理酶切验证引物1：5-CCG CTC GAG CCA GGA GGA ACA CGA GA-3引物2：5- GTAGAGAATGAATTCAGAGTCCTG -3引物3：5- CAGGACTCTGAATTCATTCTCTAC-3引物4：5-CGC GGA TCC

5、CAG CAT AGG AAG GGA GAC -3引物设计思考题：1. 酶切位点怎样选择？2. 选择双酶切有什么优点？3. 为什么要设计保护碱基？4. 载体的Amp抗性有什么作用？Xho BamH EcoR 预期实验结果与讨论图1：产物I 电泳图2：产物II 电泳图3：产物I 回收图4：产物II 回收思考题：图1下方比较模糊的条带成因？446bp314bp预期实验结果与讨论图5：全长片段电泳图6：全长片段电泳回收图8：载体酶切电泳图9：载体酶切电泳回收图7：全长片段酶切醇沉回收736bp思考题：1. 电泳胶浓度及marker选择原则？736bp图10：小提质粒1-3：不同单克隆4： EcoR14 marker5-8：不同单克隆13246578图11：BamHI/XhoI酶切验证1-7不同单克隆酶切8. DL2000 marker12345678736bp 预期实验结果与讨论思考题：1. 质粒电泳为什么有多条带？2. 图11未切出片段可能原因？图12：EcoRI单酶切阳性结果1-2. 单克隆1酶切3-4. 单克隆3酶切5. DL2000 marker12345245bp 预期实