【精品】植物活性多糖的分离、纯化与鉴定

1、实验四、植物活性多糖的分离、纯化与鉴定第一部分多糖的提取、纯化【实验目的】1、了解多糖提取和纯化的一般方法。2、学习多糖的定量测定方法。【实验原理】多糖类物质是除蛋白质和核酸之外的又一类重要的生物大分子。早在60年代，人们就发现多糖复杂的生物活性和功能。多糖是普遍存 在于自然植物界中的由许多相同或不同的单糖以a 或b 糖昔键所组 成的化合物，其分子量一般为数万甚至数百万，是构成生命活动四大 基本物质之一，与维持生命功能密切相关。大部分植物多糖不溶于冷 水，在热水中呈粘液状，遇乙醇能沉淀。多糖具有抗氧化性.抗病毒 性、反互补特性1,大量药理及临床研究表明，多糖类化合物是一种 免疫调节剂，它具有明

2、显的抗补体活性和促进淋巴细胞增殖作用，能 激活免疫受体，提高机体的免疫功能，在用于癌症的辅助治疗中，具 有毒副作用小.安全性高、抑瘤效果好等优点2。本实验采用常规法（即水溶醇沉法）从植物组织中提取出水溶性粗多糖，对提取得到的多糖进行分离纯化，除去色素及小分子杂质, 并采用sevage法除蛋白。用蔥酮比色法测定多糖的含量。多糖的纯化，就是将存在于粗多糖中的杂质去除而获得单一的多糖组分。一般是先脱除非多糖组分，再对多糖组分进行分级。常用的 去除多糖中蛋白质的方法有：sevag法、三氟三氯乙烷法、三氯醋酸 法，这些方法的原理是使多糖不沉淀而使蛋白质沉淀，其中sev昭方 法脱蛋白效果较好，它是用氯仿：

3、戊醇或丁醇，以4： 1比例混合，加 到样品中振摇，使样品中的蛋白质变性成不溶状态，用离心法除去。本实验采用sev聘法（氯仿：正丁醇=4： 1混合摇匀）进行脱蛋白,用deae 纤维素层析柱进行纯化，然后合并多糖高峰部分，浓缩后 透析，冻干，得多糖组分。多糖被浓硫酸水合产生的高温迅速水解，产生单糖，并迅速脱水生成醛糖衍生物，在这种强酸条件下与苯酚反应生成橙色衍生物，该 衍生物在波长490 nm处和一定浓度范围内，吸光度与糖浓度呈线性关系，采用比色法对多糖含量进行测定。【实验试剂和器材】1 试剂活性炭、硫酸，5%苯酚溶液，葡萄糖，过氧化氢，乙酸铅，丙酮，乙醇、无水乙醇na2hp04 12h20 na

4、h2p04 2h20 乙瞇o.olmol/l tris-hcl, ph=72。洗脱液：a: o.lmol nacl, 0.01 mol tris-hcl ph=7.2;0.5mol nacl, 0.01 mol tris-hcl ph=72。sevag试剂:氯仿：正丁醇=3：2 材料 香蕉皮粉末 市售香蕉的皮。3 器材 多功能粉碎机、恒温水浴锅、deae-纤维素，离心机，透析袋、分光 光度计、层析柱(2. 5 x 30cm)【操作方法】一、粗多糖的提取 将香蕉皮切碎烘干后，粉碎过筛。称取2g,采用热水浸提法，每次原 料和水之比均为10,浸提温度为80°c,浸提时间l5h,共提取4 次

5、，合并4次浸提液。浓缩一倍体积。对多糖提取液需进行脱色处理, 即以1%的比例加入活性炭，搅拌均匀15min后过滤即可。在浓缩液 中加入3倍体积的95%乙醇搅拌,置冰箱24 h，沉淀为多糖和蛋白质的混合物，此为粗多糖。它只是一种多糖的混合物，其中可能存在中性 多糖、酸性多糖、单糖、低聚糖、蛋白质和无机盐，必须进一步分离 纯化。二、粗多糖的纯化粗多糖溶液置于分液漏斗中，按照提取液体积的1/5量加入sevag试 剂（氯仿：正丁醇=3： 1混合摇匀），振荡20 min, 3 000 r/min的转速下，离心15 min,得上清液测其体积，继续加相应体积的sevag试剂,并重复上述操作，直至氯仿层与正丁

6、醇层之间无乳白色变性蛋白质析 出为止。收集上清液，加足量活性炭，摇匀，恒温30min,过滤，得滤 液备用。将上述滤液倒入下端扎好的截流分子量为6 0008 000的半透膜袋中，将袋的另一端用绳扎好后，悬挂在盛有水的烧杯里，将烧杯放 在磁力搅拌器上，开动搅拌，蒸憎水透析48 h,期间每2h更换一次水,经常更换清水使透析膜内溶液的浓度差加大，并加以搅拌，加快透析 速度，除去无机盐、单糖、双糖等小分子杂质。加3倍体积95%乙醇 醇沉。沉淀放入冰箱干燥，获得白色固体粉末，即得精制香蕉皮多糖。三、多糖的测定（苯酚硫酸法）1祥品溶液的制备精密称取适量样品，用蒸馄水溶解，定容至50 ml,即为待测样液。2

7、标准曲线的制备精密称取105°c干燥至恒重的葡萄糖标准品1 g,鼾 100 ml容量瓶中，溶解并稀释至刻度，配成10 mg/ml的标准贮备液，吸上述贮备 液1 ml定容至100 ml,配成0.1 mg/ml的工作液。精密移取葡萄糖标准液 0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6 ml 于 25 ml 具塞 刻度试管中，加蒸馅水至2.0 ml,再各加5%苯酚溶液1.0ml摇匀,迅速加入浓h2so4溶液5 ml,5 min,放置10 min,置沸水浴中加热20 min,取出冷却至室温，于490 nm,以试剂空白为参比测定吸光度。3 样品

8、测定取2支试管各加入样品溶液2ml,按标准曲线制备方法操作，测定每只试管中反应液的吸光度值。从标准曲线上查得相应的多糖含量。并计算百分得率。三多糖条件的研究（一）单因素实验1 料液比的影响 准确称量一定量的香蕉皮粉五份，料液比分别为1:10、1:15、1:20、1:25和1:30,提取温度为75°c,提取1次，时间为2h。按一、二中方法操作，测出吸光度。2 提取时间的影响料液比为1:20,提取温度75°c,提取1次，每次提取时间分别为0.5、1.0、1.5 和 2.0ho、二中方法操作，测出吸光度3 提取温度的影响准确称取香蕉皮粉六份，料液比为1:20,分别在70、75、8

9、0、85、90和95°c条件下，提取1次，提取时间l.oho按照一、二中方法操作, 测出吸光度。4 提取次数的影响 在料液比为1:20,提取温度为80°c条件下，分别提取1、2、3. 4次,每次提取时间为lh。按一、二中的步骤操作，测出吸光度。（二）提取条件的优化在单因子条件探讨的基础上，制定因素水平表：考察四个因素（料液比、温度、提取次数、每次提取时间），每个因素取三个水平（如温度选择75°c、0 °c和85 °c三个水平）。如表1。表1因素水平表因素a每次提取时间b温度料液比d提取次数水平10.5751: 10221.0801： 15331

10、.5851： 204(h)(°c )(n)利用正交试验设计，选择正交表l9 （34）表研究香蕉皮多糖的最佳 提取条件。率试验号abc料液比d次数时间(h)温度(°c )10.5751:15220.5801:20330.5851:25441.0751:20451.0801:25261.0851:15371.5751:25381.5801:15491.5851:202表2正交试验结果与分析得吸光度 ()k2k3极差r最优方案第二部分多糖的鉴定【实验目的】了解薄层层析法分析单糖组分的原理和方法。【实验原理】采用薄层层析法分析单糖组分。薄层层析显色后，比较多糖水解所得单糖斑点的颜色

11、和rf值与不同单糖标样参考斑点的颜色和rf值, 确定样品多糖的单糖组分。【实验试剂和器材】1 试剂硅胶、浓硫酸，氢氧化顿。展开剂:正丁醇:乙酸乙酯：异丙醇：醋酸:乙醇:水:毗喘=7： 20：12： 7： 6： 6o显色剂：1, 3二轻基蔡硫酸溶液（0.2%1, 3二轻基秦乙醇溶液）:浓硫酸=1： 0.04 (v/v) o单糖标准品。2器材烘箱、玻璃板【实验操作】、单糖组分分析1.薄层板制备：称取硅胶5g于50ml烧杯中，加入用12 ml 0.3mo 1/l磷酸二氢钠水溶液，用玻璃棒慢慢搅拌至硅胶分散均匀，铺在玻璃板上（7scmxlocm）, 110°c活化lh。即置有干燥剂的干燥箱中备用。2.点样：称取少许的多糖（01克）于2. oml离心管中，加入1m的硫酸iml,沸水浴水解2h,然后加氢氧化顿中和至中性，过滤除去硫 酸锲沉淀，得多糖水解澄清液。以此水解液和单糖标准品进行点样进 行薄层层析展开。用点样器点样于薄层板上，一般为圆点，点样基线 距底边2.0cm,点样直径为24mm,点间距离约为1.52.0cm,点 间距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜。点样时必须注意勿损伤 薄层表面。3展开：展开室如需预先用展开剂饱和，将点好样品的薄层板放入展