chp20细胞生长课件

1、 植物组织和细胞培养植物组织和细胞培养是指在无菌和人工控制的营养（培养基）及环境条件（光照、温度等）下，研究植物的细胞、组织和器官以及控制其生长发育的技术。 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 一、基本概念一、基本概念1、植物组织和细胞培养、植物组织和细胞培养幼苗及较大植株的培养，即为“植物培养植物培养” ；从植物体各种器官的外植体增殖而形成的愈伤组织的培养叫做“愈伤组织培养愈伤组织培养” ；植物无菌培养技术分如下几类：植物无菌培养技术分如下几类：能够保持较好分散性的离体细胞离体细胞或较小细胞团较小细胞团的液体培养，称为“悬浮培养悬浮培养” ；离体器官的培养，如茎尖、根尖、叶片、花器官各部分原

2、基原基或未成熟的花器官未成熟的花器官各部分以及未成熟果实的培养，称为“器官培养器官培养”未成熟或成熟的胚胎未成熟或成熟的胚胎的离体培养，则为“胚胎培胚胎培养养” 。 悬浮培养悬浮培养是指在液体培养基中，能够保持良好分散性的细胞和小的细胞聚集体的培养。在此培养条件下组织化水平较低。2 2、悬浮培养、悬浮培养3、细胞培养、细胞培养 分生组织培养分生组织培养又称生长锥培养生长锥培养，是指在人工培养基上培养茎端分生组织细胞。分生组织，如茎尖分生组织的部位仅限于顶端圆锥区圆锥区，其长度不超过0.1 mm。研究表明，通过组织培养技术进行植物的快速繁殖试验时往往并没有利用这么小的外植体，而是利用较大的茎尖组

3、织，通常包括12个叶原基。 4、分生组织培养、分生组织培养细胞培养是指利用单个细胞进行液体或固体培养，诱导其增殖及分化增殖及分化。其目的是为了得到单细胞无性繁单细胞无性繁殖系殖系。5、外植体、外植体 外植体外植体是指用于植物组织（细胞）培养的器官或组织（的切段切段），植物的各部位如根、茎、叶、花、果、穗、胚珠、胚乳、花药和花粉等均可作为外植体进行组织培养。6、器官形成、器官形成 器官形成器官形成一般是指在组织培养或悬浮培养物中芽、根或花等器官的分化与形成分化与形成。或者在先形成的小根基小根基部迅速形成愈伤组织部迅速形成愈伤组织，然后再形成芽形成芽；或者在不同部位分别形成芽和根芽和根之后，再形成

4、维管组织维管组织而将二者连成一个轴，最后形成小植株小植株。 如果在培养过程中小植株的发生途径与正常的受精卵发育方式极为近似极为近似时，通常称为“胚胎形成胚胎形成” 。当在体细胞或花药培养中培养物是小孢子这样的单倍体单倍体细胞细胞，其所形成的胚胎结构叫做“胚状体胚状体”（或“不定胚” ）。7、无性繁殖系、无性繁殖系 无性繁殖系（clone）又叫克隆克隆，是指使用母体培养物反复进行继代培养继代培养时，通过同种外植体而获得越来越多的无性繁殖后代而言，如根无性系、组织无性根无性系、组织无性系、悬浮培养物无性系系、悬浮培养物无性系等。在上述无性系无性系的培养中，有时其局部的组织无论在结构、生长速度以及颜

5、色方面都表现出明显的区别，如继续进行选择培养选择培养，则从同一无性系可分离形成二个或多个不同的系列，该系列称为“无性系的变异体无性系的变异体”8、突变体、突变体 细胞本身发生遗传变异或应用诱变处理发生的遗传变异所得的新细胞，即为突变体突变体。由单细胞形成的无性系称为“单细胞无性系单细胞无性系”；如果这种单细胞无性系是从同一组织分离得到的，并彼此不同时，叫做“单单细胞变异体细胞变异体”。9、继代培养、继代培养 由最初的外植体上切下的新增殖的组织，培养一代称为“第一代培养”。连续多代的培养即为“继代培继代培养养”，又称“连续培养连续培养”。但习惯上“连续培养”一词多用于不断加人新的培养基，并连续收

6、集培养物以保持平衡而进行的长期不转移的悬浮培养。 二、植物细胞的结构特征植物细胞由细胞壁和原生质体细胞壁和原生质体两部分组成。原生质体包括细胞质、细胞核和液泡。细胞质和细胞核组成原生质。后含物常存在于细胞质和液泡中。与动物细胞与微生物细胞相比，植物细胞有3个特点，即具有细细胞壁、液泡和质体（如叶绿体）胞壁、液泡和质体（如叶绿体） 通常要采用化学或机械的方法加以控制。 植物细胞培养的基本技术植物细胞培养的基本技术 、植物材料的准备、植物材料的准备 用于植物组织培养的外植体外植体，必须是无杂菌材料。如果不是取自种子库种子库，而是来自温室或生长在大田植物的种子、幼苗、器官、组织等，因此培养前必须对外

7、植体进行严格的灭菌处理灭菌处理。 原则上原则上应尽可能选择那些灭菌后易于除去或容易分灭菌后易于除去或容易分解的试剂。解的试剂。灭菌剂的选择和处理时间选择和处理时间的长短取决于所用材料对试剂的敏感性。 二、培养基及其组成 培养基实际上是植物离体器官、组织或细胞等的“无菌土壤”，其特点是营养成分的可调控性。 植物组织和细胞培养所用培养基种类较多，但通常都含有无机盐、碳源、有机氮源、植物生长激素、维生素等化学成分。 1、无机盐2、碳源 植物细胞培养物通常均为异养细胞。因此，人们经常使用碳水化合物、肌醇作为碳源，有时也用甘油、乳糖和半乳糖等化合物。 有些培养物还可通过同化二氧化碳而获得所需的能量，此所

8、谓光自养培养物光自养培养物。3、植物生长调节剂、植物生长调节剂 植物激素植物激素是指植物代谢过程中形成的生长调节物质，在极低浓度时即能调节植物的生育过程，并能从合成能从合成部位转运到作用部位而发挥作用部位转运到作用部位而发挥作用。植物激素只限于天然产生的调节物质，到目前为止，已发现植物组织中可以形成5种植物激素，即生长素、分裂素、赤霉素、生长素、分裂素、赤霉素、脱落酸和乙烯。脱落酸和乙烯。4、有机氮源、有机氮源 5、维生素、维生素三、培养方法三、培养方法 植物细胞培养，按培养对象来说，可分为原生质原生质体培养和单倍体细胞培养体培养和单倍体细胞培养；按培养基类型可分为固固体培养和液体培养体培养和

9、液体培养；按培养方式可分为悬浮细胞培悬浮细胞培养和固定化细胞培养养和固定化细胞培养。 所谓固体培养固体培养系统实际上包括利用琼脂作为支持物的固体培养和固定化细胞培养。 固体培养的特点是简便易行简便易行、所占空间小空间小。但也有一些缺点缺点：外植体或其愈伤组织仅有一部分与培养基相接触，该部位的营养物质可被迅速吸收，从而形成培养基中营养物质的浓度差，并进而导致愈伤组织生长的不平衡； 由于外植体的基部插人固体培养基中，因此该处呈现气体交换不畅气体交换不畅的状态，阻碍了组织呼吸作用的正常进行，同时也会堆积生长过程中排出的有害物质有害物质； 在静止状态下，由于重力作用，以及光线从上部或一侧射人，因而在愈

10、伤组织细胞间出现了极化现象极化现象，结果导致细胞群体的不均匀状态。 固体培养物有时需要测定一些生理生化指标 。常用的固化剂固化剂有琼脂、藻酸盐、角叉藻聚糖、明胶、琼脂、藻酸盐、角叉藻聚糖、明胶、羟乙基纤维素、聚丙烯酰胺、淀粉和硅胶羟乙基纤维素、聚丙烯酰胺、淀粉和硅胶等。 外植体在培养3周左右周左右必须移换至新鲜培养基上，以保持培养物的继续正常生长。移换一次培养基称一次继代培养继代培养。一种外植体经过一定次数一定次数的继代培养，其培养物就可用于悬浮培养悬浮培养。由于外植体诱导形成的愈伤组织开始比较紧密坚实，所以需要经过较长时间的多次继代培养后，愈伤组织变得较为疏松愈伤组织变得较为疏松时才能进行悬

11、浮培养。 液体培养系统包括小规模的悬浮培养悬浮培养和大规模的成批培养成批培养、半连续和连续培养连续和连续培养。悬浮培养可分为静止静止和振荡和振荡两类。静止液体培养具有简便易行的特点，而且培养基还不会出现营养物质浓度差的现象。振荡液体培养，是使悬浮细胞在液体培养基中，并不断振（转）动下进行培养。 1、成批培养法、成批培养法 将培养基一次性加入反应器，接种、培养一定时间后收获细胞的操作方式称为成批培养法 。 植物细胞培养过程中，次级代谢产物的大量累积往往发生在细胞生长的稳定期稳定期，人们基于此原理设计了植物细胞的两步培养法两步培养法，即使用两个生物反应器，第一个反应器用于细胞生物量的累积累积，第二

12、个反应器用于次级代谢产物的生产生产。 2、半连续培养法、半连续培养法 在反应器中投料和接种培养一段时间后，将部分培养液和新鲜培养液进行交换的培养方法称为半连续培半连续培养法。养法。 3、连续培养法、连续培养法 连续培养法是利用连续培养反应器，在投料和接种培养一段时间后，以一定速度连续采集细胞和培养液，并以同样速度供给新鲜培养基以使细胞生长环境长期维持恒定的方法维持恒定的方法。4、固定化培养法、固定化培养法 植物次级代谢产物的累积主要在细胞生长的稳定期，表明细胞成块而趋于分化成块而趋于分化时，细胞块中各个细胞处于一定理化梯度理化梯度之下，此现象与完整植株类似，由此人们提出了植物细胞固定化培养技术

13、。 细胞位置固定，易于获得高密度细胞群体高密度细胞群体及维持细胞间的物理化学梯度物理化学梯度，利于细胞组织化利于细胞组织化，易于控制培养条件及获得次级代谢产物次级代谢产物。 细胞生长过程可归纳为细胞生长过程可归纳为：生长细胞体积倍增，可制备同步化的细胞。生长细胞复制DNA，也有蛋白质的含量变化。 制备中应特别注意以下几点制备中应特别注意以下几点：（1）生产中必须保证生产条件的一致性，以免影响质量。（2）使用转化细胞系（特别是肿瘤原性细胞系）作为制备细胞因子的基质，应使用严格的纯化手段，以去除可能引起安全性问题的污染物 。（3）在外来宿主中表达的天然的基因编码的细胞因子，其结构、生物学或免疫学性

14、质可能与天然的细胞因子不同。（4）生长程序中可能带来有害的中间产物，如内毒素、表达产物中潜在的致癌性DNA。（5）制定生产规程应详尽介绍细胞系、添加物（如诱生剂）、增强对或其他物质（如抗生素）等的特性。 二、测定方法二、测定方法 分离纯化后的细胞生长调节因子，常用放射免疫法直接测定，但其活性活性和细胞生物学作用机制细胞生物学作用机制方面的研究仍采用细胞培养测定活性细胞培养测定活性。测定中注意以下几点：（1）必须根据因子的作用特性，掌握其生长需求条件，排除细胞代谢产物细胞代谢产物的影响，若出现生长抑制生长抑制的现象，可增加或更换新鲜培养液更换新鲜培养液。（2）选择适宜的细胞培养系统和敏感的靶细胞

15、。（3）作用效应指标的选择。（4）必须采取特异性生物学试验来评价其活性。 （5）应测定比活性比活性，并有高纯度的参照品。 三、重要的细胞生长因三、重要的细胞生长因 子子1、结构和性质、结构和性质 人促红细胞生成素（hEPO）是由166个或基酸残基组成的糖蛋白激素。其分子量为21.3KD，水解并除去27个疏水氨基酸肽段后得到分子量18.4KD的激素。基因工程生产的hEPO分子量为23KD，比天然产物大，说明有少量低聚糖化。 4、作用与用途、作用与用途 促红细胞生成素主要由肾脏分泌，也可由巨噬细胞或其他细胞产生，具有刺激活体内增生红细胞的功能。 （二）表皮细胞生长因子（二）表皮细胞生长因子 196

16、2年从中提取出一种多肽能直接刺激表皮的生长和角化，故命名为表皮生长因子。 hEGF分子量为6.2KD,等电点 pH4.5 。表皮生长因子表皮生长因子4、作用与用途、作用与用途 EGF能促进细胞的增殖;实验证明EGF对体外培养的细胞的增殖刺激作用增殖刺激作用不限于上皮细胞，其作用是广谱广谱的。的。 （三）抑素（三）抑素 专指组织特异性的抗分裂素物质抗分裂素物质。定义为一种由机体内某种组织产生并通过抑制有丝分裂作用抑制有丝分裂作用来控制该组织生长的物质。 抑素抑素是一组与核酸或多糖有关的生物活性蛋白质或生物活性蛋白质或多肽多肽，其抑裂活性具组织特异性组织特异性而无种属特异性无种属特异性，也无细胞毒作用无细胞毒作用。 可望在治疗肿瘤或免疫排斥等方面发挥作用 。 第二节第二节 组织制剂组织制剂 一、组织制剂组织制剂系指采用动物的组织、器官、腺体等提取得到的具有生理作用的混合制剂。 该制剂所含成分未经纯化成单一组分，常常含有多肽、激素、核梭类物质、多糖及少量蛋白质等多种成分，组成较为复杂。二、组织制剂的一般制备方法二、组织制剂的一般制备方法 该类制剂的