实验六青贮料的细菌学检查

1、实验六 青贮料的细菌学检查一、实验前的几点儿说明点名，查看学生出勤情况。总结上次作业，提出作业中出现的问题并讲解。二、板书部分：（一）目的要求1. 掌握青贮料中乳酸菌和腐败菌的计数方法。2. 认识青贮料屮乳酸菌的形态。（二）实验内容1 青贮料屮乳酸菌的计数（示教）。2青贮料中腐败菌的计数（示教）。3. 用青贮汁液涂一张抹片并进行革兰氏染色，并在油镜下观察。（三）作业1. 试述青贮料中乳酸菌的计数方法。2 绘制乳酸菌的形态图。三、实验内容（-）青贮料样品的取样及稀释液的准备1. 青贮料样品屮的采取测定青贮料屮乳酸菌和腐败菌数口吋，首先是在青 贮窖（塔）的不同层次中，以无菌操作方式采取有代表性样品

2、20g以上备用。2称取青贮料样品将上述样品混合均匀，弃去大部分，留下20g左右，用 无菌剪刀剪碎，分别在两个平皿中各称取一份，每份5g, 一份置烘干箱中测定 水分，另一份留下作稀释用。3.稀释液的制备将留下的5g青贮料样品，置于盛有50ml无菌生理盐水的 三角瓶中（1： 10）,摇振一刻钟，取lml加入盛有9ml无菌生理盐水的试管中， 成:100即10-2稀释,如此重复再稀释成10-3、10-4、10-5、10-6的稀释液。（二）乳酸菌的计数从10-4. 10-5. 10-6稀释液中，用无菌吸管吸取lml,分别放在三个无菌 平皿屮，每个稀释度重复三次，共作九个平皿。吸取稀释液时，要先从稀释度最

3、 大的开始，依次再取稀释度较小的稀释度，这样tt节省无菌吸管。将融化并冷却至4550°c （用手摸不烫时）的口菜浸汁琼脂培养基，倾注适 量（约12-15ml）到各个不同稀释度较小的平皿内，立即在桌上轻轻与稀释液混 匀，待凝固后，倒置，分别标明相应稀释度、吋间、组别等、置30°c左右恒温 箱内，培养数日后，即可形成菌落。因乳酸菌产生乳酸，能使附近碳酸钙溶解，菌落周围呈一透明圈。但不是所 有的这种菌落都是乳酸菌，因此计数所得数字为大约的乳酸菌数。典型的乳酸菌 与人肠杆菌口j以根据透明圈大小辨别。一般乳酸菌的透明圈与人肠杆菌透明圈比 较均较大。若要较精确地计算其屮乳酸菌数，则须进

4、一步鉴定。木实验屮凡有透 明圈者均算作乳酸菌菌落。选最清晰地形成单独透明圈菌落的三个平皿，计算菌 落总数，再求三平皿的平均菌落数，最后算岀每克青贮料中乳酸菌数。对各种不 同青贮料和不同贮存时间所含乳酸菌数可以进行比较。（三）腐败菌的计数操作方法同乳酸菌的计数法，但所用培养基为营养琼脂中 加入0.4%明胶，制成明胶琼脂培养基，代替白菜浸汁琼脂培养基作倾注培养。 置37°c或38°c温箱中培养，待细菌生长后，倾明胶液化试剂于平板上面，其用 量以恰好能盖满平板为度。若明胶液化，则菌落周围呈透明圈，证明此菌能产生 蛋白酶（明胶酶gelatinase）,没有明胶酶的地方则呈现乳口色。

5、由透明区大小, 可看出细菌液化明胶的强弱。若要精确测定厌氧和好氧的腐败菌，则应在明胶琼 脂平板上，均匀涂布定量青贮料样品稀释液，进行厌氧或好氧培养后，再倾入明 胶液化试剂，观察菌落透明圈的有无。此试验的原理为试剂屮含冇升汞及浓盐酸，二者皆可使蛋白质发生白色沉淀 （明胶为一种动物性蛋口质）。若细菌能将其附近的明胶分解，则加入试剂后不 现白色沉淀。算出每克干青贮料屮腐败菌数的方法和乳酸菌的计数相同。（四）青贮料屮乳酸菌形态的认识用青贮料汁液和挑选几个乳酸菌菌落抹片，用革兰氏染色，在油浸镜下观察 其个体形态和排列方式。明胶液化试剂：升汞 15g蒸憾水100ml先将升汞溶于水中，然后再将浓盐酸加入混合

6、即成。白菜浸汁琼脂培养基新鲜甘蓝或白菜100g琼脂4g葡萄糖或蔗糖4g自来水约 150ml碳酸钙20g四、示教部分1.青贮料样品屮的采取测定青贮料屮乳酸菌和腐败菌数口吋，首先是在青 贮窖（塔）的不同层次中，以无菌操作方式采取有代表性样品20g以上备用。2称取青贮料样品将上述样品混合均匀，弃去大部分，留下20g左右，用 无菌剪刀剪碎，分别在两个平皿中各称取一份，每份5g, 一份置烘干箱中测定 水分，另一份留下作稀释用。3.稀释液的制备将留下的5g青贮料样品，置于盛有50ml无菌生理盐水的 三角瓶中（1： 10）,摇振一刻钟，取lml加入盛有9ml无菌生理盐水的试管中， 成1： 100即10-2稀

7、释,如此重复再稀释成10-3、10-4、10-5、10-6的稀释液。4乳酸菌的计数从10-4. 10-5. 10-6稀释液中，用无菌吸管吸取lnil, 分别放在三个无菌平皿中，每个稀释度重复三次，共作九个平皿。吸取稀释液吋, 要先从稀释度最大的开始，依次再取稀释度较小的稀释度，这样可节省无菌吸管。5. 将融化并冷却至45 - 50°c （用手摸不烫时）的口菜浸汁琼脂培养基，倾 注适量（约12-15ml）到各个不同稀释度较小的平皿内，立即在桌上轻轻与稀释 液混匀，待凝固后，倒置，分别标明相应稀释度、时间、组别等、置30°c左右 恒温箱内，培养数f1后，即可形成菌落。6. 因乳

8、酸菌产生乳酸，能使附近碳酸钙溶解，菌落周围呈一透明圈。但不是 所有的这种菌落都是乳酸菌，因此计数所得数字为大约的乳酸菌数。典型的乳酸 菌与大肠杆菌可以根据透明圈大小辨别。一般乳酸菌的透明圈与大肠杆菌透明圈 比较均较大。若耍较精确地计算其中乳酸菌数，则须进一步鉴定。本实验中凡有 透明圈者均算作乳酸菌菌落。7. 腐败菌的计数操作方法同乳酸菌的计数法，但所用培养基为营养琼脂屮加 入0.4%明胶，制成明胶琼脂培养基，代替白菜浸汁琼脂培养基作倾注培养。置37°c或38°c温箱中培养，待细菌生长后，倾明胶液化试剂于平板上面，其用量 以恰好能盖满平板为度。若明胶液化，则菌落周围呈透明圈，

9、证明此菌能产生蛋 白酶（明胶酶gelatinase），没有明胶酶的地方则呈现乳白色。由透明区大小， 可看出细菌液化明胶的强弱。若要精确测定庆氧和好氧的腐败菌，则应在明胶琼 脂平板上，均匀涂布定量青贮料样品稀释液，进行厌氧或好氧培养后，再倾入明 胶液化试剂（试剂中含有升汞及浓盐酸），观察菌落透明圈的有无。五、实验中应注意的几个问题1.在取样吋，要在青贮窖（塔）的不同层次屮取。然后充分混匀，这样才能 代表整个青贮窖的微生物的水平。2在吸取稀释液时，耍先从稀释度最大的开始，依次再取稀释度较小的稀释 度，这样可节省无菌吸管，又能保证实验的准确性。六、作业1. 试述青贮料屮乳酸菌的计数方法。2. 绘制乳

10、酸菌的形态图。七、实验总结1 木实验主要是掌握青贮料中乳酸菌和腐败菌的数量的测量。2. 在取样时，要在青贮窖（塔）的不同层次中取。然后充分混匀，这样才能 代表整个青贮窖的微生物的水平。八、附：实验所需物品一、试验材料名称组别 数量合计 备注1、提前两周准备青贮料：碎白菜和鸡饲料混匀装广口瓶，放入30度温箱2、白菜汁培养基（提前1周制备并接种）3、平 111l524、擦镜纸5、酒精棉球6、双壁瓶517、香柏油1瓶8、二甲苯1瓶9、标木盒5110放擦镜纸、酒精棉球5盛香柏油、二卬苯5放标本片10、载玻片:分5组,每组12张（6人每人制2张片）,60张片+20张片（供老师示教和学生选择）染色液（美蓝

11、1瓶、革兰氏染液1套4瓶）5套（注：提前一周检杳和配制染色液）吸水纸5本下口瓶5个提而加入水半瓶废液缸5个用后废液注意处理示教用：培养皿10套200ml生理盐水试管每班4只5ml吸管2只仪器设备名称显微镜每人1台干燥箱1台水浴锅1台培养箱1台表1*试验仪器设备统计表学院牧医工程 实验室名称畜牧微牛物 实验名称 实验八青贮料的细菌学检查仪器设备名称数墨 冶、套）备注显微镜32干燥箱1台水浴锅1台培养箱1台表次试验试剂消耗情况统计表学院牧医 实验室名称畜牧微牛物 实验名称 买验八青贮料的细菌学检查zru厶 ln-hr¥ia 1一4pft小毛、容 试剂名称'x验人数数消量水价消u卅1冃 利况 用香柏油二甲苯美蓝革兰氏染液3030303055551瓶1瓶1套1套合计表3.实验用低值易耗品及实验动物统计表系别： 牧医实验室名称： 畜牧微生物实验名称:实验八 青贮料的细菌学检查实 佥玻璃仪器器