平面色谱法(山西医科大学)

1、第十九章平面色谱法平面 色谱法(plane chromatography ) 是组分在以平面为载体的 固 定相和流动相之间吸附或分配平衡而进行的一种色谱方法。该法具有 操作简单，不需要昂贵的仪器设备，分析速度快，结果直观，并有较 高的分离能力。平面色谱法主要包括薄层色谱法 (thin layer chromatography ； TLC ) 和 名氏 色谱法 (paper chromatograph )。名氏色谱 法出现于20世纪的40年代，主要用于微量分析，特别在生化和医药 分析中的应用十分广泛。但色谱纸的机械强度较差，传质阻力大，使 该法的应用和推广受到了限制。20世纪60年代，薄层色谱法

2、的发展 和普及，使得纸色谱法的应用逐渐减少。20世纪80年代出现了仪器 化薄层 色谱法(instrumental thin layer chromatography ), 薄层 色谱的 每一步骤均由仪器来代替以往的手工操作，再配以薄层扫描仪，这样 就使在较长时期内被认为只能用来定性和半定量的薄层色谱法定量结 果的重现性和准确度大大提高，成为一种有价值的分离分析方法。第一节平面色谱法的分类和原理一、 平面色谱法的分类平面色谱法按操作方式可分为：1 .薄层色谱法 薄层色谱法是把固定相均匀地涂布在玻璃板、塑 料板或铝箔上形成厚薄均匀的薄层，在此薄层上进行混合组分分离的 色谱法。按照薄层色谱法的分离机

3、制不同，薄层色谱法又可分为吸附 薄层色谱法、分配薄层色谱法和分子排阻薄层色谱法。2 .纸色谱法 纸色谱法的固定相一般为纸纤维上吸附的水分，流 动相为与水互不相溶的有机溶剂，根据被分离混合组分在水和有机溶 剂中的溶解能力不同，在色谱纸上产生差速迁移而得到分离的方法。 纸色谱分离原理属于分配色谱的范畴。3 .薄层电泳法 薄层电泳法是带电荷的被分离物质（蛋白质、核 甘酸、多肽、糖类等）在纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺 凝胶等惰性支持体上，以不同速度向其电荷相反的电极方向泳动，产 生差速迁移而得到分离的方法。薄层电泳法属于平面色谱范围，但由 于电泳与色谱的驱动力、仪器设备及测定对象与薄层色谱法

4、及纸色谱 法有较大差别，故本章不予介绍。二、平面色谱法参数平面色谱与柱色谱的基本原理相同，但操作方法不同，故各种参 数也不完全相同。以下主要介绍平面色谱法的定性参数、相平衡参数、 面效参数和分离参数。（一）定性参数薄层色谱的定性参数是色谱过程热力学特性参数，包括比移值与 相对比移值。1 . 比移佰（retardation factor ; RD 比移 值是在一定条件下，溶 质移动距离与流动相移动距离之比。是平面色谱法中用来表征平面色 谱图上斑点位置的基本参数，也是平面色谱法用于定性的基本参数。Rf =-L（ 19-1 ）Lo式中L为原点（origin ）至斑点中心的距离，L 0为原点至溶剂前

5、沿（solvent front ）的距离（见图19-1 ）。当Rf =0时，组分不 随流动 相展开，停留在原点，表示组分在固定相上完全保留；当Rf =1时， 组分随流动相展开至溶剂前沿，表示组分在固定相上完全不保留。所 以Rf值在01之间。在实际工作中，Rf值适宜范围是0.20.8 ,最佳 范围是0.30.5 o图19-1 平面色谱示意图由于Rf受被分离组分的结构和性质，固定相和流动相的种类和性质，展开室内的饱和度、温度等多因素的影响。在不同实验室或不同 实验者间进行同一化合物Rf值的比较是很困难的。2 . 相对 比移值(relative retardation factor ; Rr)相 对

6、比移 值是在一定条件下，被测组分的比移值与参考物质比移值之比。Rr = Rf(i)- L(19-2 )Rf L(s)式中Rf (i)和Rf (s)分别为组分i和参考物质s在相同条件下的比移 值。L和L(s)分别为组分i和参考物质s在平面色谱上的移动距离。相对比移值在一定程度上消除了测定中的系统误差，因此与比移 值相比具有较高的重现性和可比性。测定Rr时，可以选择纯物质加到 试样中作为参考物质，也可以是试样中的某一已知组分。Rr可以大于 1,也可以小于1。Rr与被测组分、参考物质、色谱条件等因素有关。(二)相平衡参数1 . 分 配系数(distribution coefficient ; K)

7、保留因 子(retention factor ; k) 平面色谱法中的相平衡参数也可用分配系数和保留因子 来描述(见第十六章 色谱法概论)。2 . K、k与Rf值之间的关系 设R'为单位时间内一个分子在流动 相中出现的几率(即在流动相中停留的时间分数)，若R'=1/3，则表示 这个分子有1/3的时间在流动相中，2/3的时间在固定相中。对于具有 统计意义的大量待测组分分子而言，则表示1/3的分子在流动相中， 2/3的分子在固定相中。组分在固定相与流动相中的量可分别用csVs 和cmVm表示，Cs为组分在固定相中的浓度，cm为组分在流动相中的 浓度，Vs为色谱平面中固定相所占的体积

8、，Vm为平面中流动相所占的(体积。 因 止匕，'= " s = K sRCmVmVm整理上式，得r'=1 kR'也可表示组分分子在平面上移动的速度，若R'=1/3 ,则表示组 分分子的速度(u)为流动相分子速度(U0)的1/3( u/u0),即该组分分子移行的距离是溶剂前沿移行距离的1/3。由此可得，Rf= =比，在平LoUot面色谱中，组分分子与流动相分子的移行时间是相同的(定时展开)，(19-3 )所以Rf = R ,即RfRf =11 KVs/Vm(19-5 )(19-4 )22由(19-5 )可知：(1)由于组分不同，热力学常数K值不同，在平面

9、色谱上的Rf 不同，所以平面色谱可以把不同的组分分离出不同的斑点。(2)当K (k) <0.01时，R = 1,此时L = Lo,表示组分不被固定 相保留，随流动相移至溶剂前沿；当K ( k) >100时，Rf-0,此时 L=0,表示组分停留在原点，完全被固定相所保留。因此平面色谱一 般要求：0.01 <K< 100。(3)由(19-5)得 K=Vm(1 -1)(19-6)Vs Rf由上式可知，只要测出某组分在液-液分配薄层色谱体系的R,并 已知流动相和固定相体积比Vm/Vs,即可测出该体系的分配系数Ko(三)面效参数1 . 理论塔 板数(number of theor

10、etical plate ； n) 理论塔板数是 反映组分在固定相和流动相中动力学特性的色谱参数，是色谱分离效(19-7 )能的重要指标。以下式表小：n = 16()2W式中L为原点到斑点中心的距离，W为组分斑点的宽度，因此在 斑点移动距离相等的情况下，斑点越集中，W越小，n越大，说明面 效越高。在平面色谱法中的理论塔板数主要取决于平面色谱系统的物 理特性，如固定相的粒度、均匀度、活度、色谱纸的厚薄及其均匀度， 展开剂的流速及展开方式等。2 . 塔 板高度（height of theoretical plate ; H） 塔 板高度 是由理 论塔板数及原点到展开剂前沿的距离（Lo）算出的单位理

11、论塔板的长度。即：H =（ 19-8 ）n由此可见，H与n成反比，n值越大，H值越小，面效就越高。（四）分离参数1 .分离度（resolution : R） 分离度是两相 邻斑点中心距离与两 斑点平均宽度的比值，是平面色谱法的重要分离参数。刈 2dW W2) (WVW2)(19-9 )式中L2、Li分别为原点至两斑点中心的距离，d为两斑点中心问 的距离，Wi、W2为两斑点的宽度；在薄层扫描图上，d为两色谱峰顶 间距离，Wi、W2分别为两色谱峰宽（见图19-2）。在平面色谱法中， R> 1较适宜。图19-2 平面色谱分离度示意图2 . 分离数（separation number j SN）

12、 分离 数是在 相邻两 斑点分 离度为1.177时，在Rf=0和Rf=1两组分斑点之间所能容纳的色谱斑 点数。即：SN =L0-1（19-10）（Wi2）0 （W1J1式中（Wi/2）0和（Wi/2）i分别为由薄层扫描所得的Rf=0和Rf=1的组 分的半峰宽。实际上，（Wi/2）0和（Wi/2）1均不能直接由薄层扫描图上测 得。而是通过测量其他组分的Rf值和半峰宽，二者在一定点样量范围 内成直线关系，由回归方程外推求得（Wi/2）0和（Wi/2）1。分离数也是平 面色谱法的重要分离参数和面效的评价参数。在一定分离度下，分离 数SN越大，平面的容量越大。一般薄层板的SN在10左右，高效薄 层板可

13、达20 o第二节薄层色谱法薄层色谱法是平面色谱法中应用最广泛的方法之一。将细粉状的 吸附剂或载体（固定相）涂布于玻璃板、塑料板或铝箔上，成一均匀 薄层并进行活化，将试样与对照品溶液点在同一薄板的一端（原点）， 在密闭的容器中用适当的溶剂（流动相或展开剂）展开，显色后样品 斑点与对照品斑点进行比较，用于定性鉴别和含量测定。铺好薄层的 板，称为薄板或薄层板（thin layer plate ）。薄层色谱法具有以下特点： 分离能力强，斑点集中。灵敏度高，几微克，甚至几十纳克的物 质也能检出。展开时间短，一般只需十至几十分钟。一次可以同时 展开多个试样。试样预处理简单，对被分离组分性质没有限制。 上样

14、量较大。所用仪器简单，操作方便。因此在实际工作中特别是 基层实验室薄层色谱法是一种被广泛应用的分离分析技术。一、 薄层色谱法的主要类型根据薄层色谱法的分离机制，可分为吸附薄层色谱法、分配薄层 色谱法和分子排阻薄层色谱法，此外，还有胶束薄层色谱法等。根据 分离效能，薄层色谱法又可分为经典薄层色谱法和高效薄层色谱法。 本节主要讨论吸附薄层色谱法。（一）吸附薄层色谱法吸附薄层色谱法是以吸附剂为固定相的薄层色谱法。在吸附薄层 色谱中，将含有A、B两组分的混合溶液点在薄层板的一端，在密闭 的容器中，用适当的溶剂展开。在展开过程中A、B两组分首先被吸 附剂吸附，然后被展开剂溶解而解吸附，并随展开剂向前移动

15、，遇到 新的吸附剂A、B两组分又被吸附、随后又被展开剂解吸附。由于A、 B两组分在吸附剂和展开剂中的吸附系数不同，在薄层板上进行无数 次的吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，吸附系数大的在板上移动速 度慢，Rf值小；吸附系数小的在板上的移动速度快，Rf值大，在薄层 板上产生差速迁移而得到分离。在吸附色谱中，一般极性大的组分Rf 值小，极性小的组分Rf值大。（二）分配薄层色谱法分配薄层色谱法是以液体为固定相的薄层色谱法。利用试样中各 组分在固定相与流动相之间的分配系数不同，在薄层板上进行无数次 的分配，分配系数大的组分在板上移动速度慢，Rf值小；分配系数小 的组分在板上的移动速度快，Rf值大，在薄层

16、板上产生差速迁移而得 到分离。根据固定相和流动相极性的相对强弱，分配薄层色谱法可分 为正相薄层色谱法和反相薄层色谱法。1 .正相薄层色谱法正相薄层色谱法是流动相的极性小于固定 相极性的薄层色谱法。正相薄层色谱中组分极性越大，分配系数越大， 随展开剂移动的速度越慢，Rf值越小。正相薄层色谱法常用的固定相 是含水硅胶，展开剂是极性较弱的有机溶剂。2 .反相薄层色谱法反相薄层色谱法是流动相的极性大于固定 相极性的薄层色谱法。反相色谱中组分极性越小，分配系数越大，随 流动相移动的速度越慢，Rf值越小。反相薄层色谱法常用的固定相是 烷基化学键合相，展开剂是水或水-有机溶剂的混合溶剂。二、吸附薄层色谱的吸

17、附剂和展开剂（一）吸附剂吸附薄层色谱法的固定相为吸附剂（absorbent ）,常用吸附剂有硅 胶、氧化铝和聚酰胺等。1 .硅胶硅胶是吸附薄层色谱中最常用的固定相。硅胶是多孔性 无定形粉末，其表面带有硅醇基（silanol ）呈弱酸性，通过硅醇基吸 附中心与极性基团形成氢键而表现其吸附性能，由于不同组分的极性 基团与硅醇基形成氢键的能力不同，在硅胶作为吸附剂的薄板上被分 离。硅胶吸附水分形成水合硅醇基而失去吸附能力，但将硅胶在105 110 c左右加热时，可失去水而提高活度，增加吸附能力，这一过程称 为“活化"（activation ）。硅胶的活度与含水量的关系见表19-1。含水 量

18、越多，级数越高，吸附能力越弱，同一组分在此硅胶上的Rf值越大； 含水量越少，级数越低，吸附能力越强，同一组分在此硅胶上的Rf 值越小。硅胶的分离效率的高低与其粒度、孔径及表面积等几何结构有关。 硅胶粒度越小，粒度越均匀，粒度分布越窄，其分离效率越高。经典 薄层色谱用硅胶的粒度为10 40 pm。比表面积大，意味着试样与固定 相之间有更强的相互作用，即有较大的吸附力或较强的保留。商品硅 胶比表面积一般为400 600m 2/g,孔体积约为0.4ml/g ,平均孔径约为 100nm 。硅胶表面的pH = 5 , 一般适合酸性和中性物质的分离，如有机酸、 酚类、醛类等。碱性物质与硅胶发生酸碱反应，展

19、开时严重被吸附、 斑点拖尾、甚至于停留在原点不随流动相展开。薄层色谱常用硅胶有硅胶H、硅胶G、硅胶GF254等。硅胶H为 不含粘合剂的硅胶，铺成硬板时需另加粘合剂。硅胶G是硅胶和煨石 膏混合而成。硅胶GF254含煨石膏，另含有一种无机荧光剂，即钻激 活的硅酸锌（Zn2SiO4： Mn）,在254nm紫外光下呈强烈黄绿色荧光背 景。此外，还 有硅胶 HF 254、硅胶HF254+366 等。2 .氧化铝 氧化铝是由氢氧化铝在400500 C灼烧而成。氧化铝 可分为中性（pH7.5 ）,碱性（pH9.0 ）和酸性（pH4.0 ）三种。一般碱 性氧化铝用来分离中性或碱性化合物，如生物碱、脂溶性维生素

20、等， 中性氧化铝适用于酸性及对碱不稳定的化合物的分离，酸性氧化铝可 用于酸性化合物的分离。氧化铝的活性与含水量有关（见表19-1）。 含水量越高，活性越弱。表19-1硅胶、氧化铝的活度与含水量的关系硅胶含水量氧化铝含水量活性级活性活化00I蒿一般活化53n硅胶：110 c/30min ,156m氧化铝：110 c/45min强活化2510w1r硅胶：150c/4h,3815V低氧化铝：180 c /4h3 .聚酰胺 聚酰胺是由酰胺聚合而成的高分子化合物，常用的 是聚己内酰胺。聚己内酰胺为白色多孔的非晶型粉末，不溶于水和一 般有机溶剂，易溶于浓矿酸、酚及甲酸。聚酰胺分子内的酰胺基可与 化合物质子

21、给体形成氢键而对该类化合物产生吸附。聚酰胺可用于酚、 酸、硝基、酶类等化合物的分离。（二）展开剂薄层色谱法 的流动 相又称 展开齐1J （ developing solvent , developer ）。 展开剂选择是薄层分离结果优劣的重要条件之一。在吸附薄层色谱法 中，选择展开剂的一般原则和吸附柱色谱中选择流动相的原则相似， 主要是根据被分离物质的极性、吸附剂的活度和展开剂的极性三者的 相对关系进行选择，通过组分分子与展开剂分子争夺吸附剂表面活性 中心而达到分离。Stahl设计了选择吸附薄层色谱条件的三者关系示意 图（见图19-3 ）,由图可见，将图中的三角形A角指向极性物质，则 B角就指

22、向活性小的吸附剂，C角就指向极性展开剂，如此类推。图19-3化合物的极性、吸附剂活度和展开剂极性间的关系薄层色谱法中常用的溶剂按极性由强到弱的顺序是：水酸叱噬甲醇乙醇正丙醇丙酮乙酸乙酯乙醴 氯仿二氯甲烷甲苯苯三氯乙烷四氯化碳环己烷石油 醴。在薄层色谱中，通常根据被分离组分的极性，首先用单一溶剂展 开，由分离效果进一步考虑改变展开剂的极性或选择混合展开剂。例 如，某物质用氯仿展开时，Rf值太小，甚至停留在原点，可选择另一 种极性更强的展开剂或加入一定比例的极性溶剂，如乙醇、丙酮等。 如果Rf值较大，斑点在前沿附近，应选择另一种极性更弱的展开剂或 加入一定比例极性小的溶剂，如环己烷、石油醴等。为了

23、寻找合适的 展开剂，往往需要多次实验，有时需要两种以上溶剂的混合展开剂， 甚至要加入一些酸或碱。常用的薄层色谱混合展开剂见表19-2。表19-2 常用薄层色谱混合展开剂样 品配方举例备注亲水性样品正丁醇+乙酸+水（4+1+5） 异丙醇+氨水+水（9+1+2）苯酚+水（4+5）（1 ） 三种溶剂按比例 混合，用分液漏斗充分 振摇混合后，取有机层。（2 ） 混合溶剂配比按 样品极性而定。中强度亲水性样品三氯甲烷+甲酰胺三氯甲烷+甲醇乙酸乙酯+甲醇三、薄层色谱操作方法薄层色谱法一般操作程序可分制板、点样、展开和斑点定位。（一）薄层板的制备薄层板可分为加粘合剂的硬板和不加粘合剂的软板两种。软板制 备简

24、便，但表面松散，很易吹散、脱落，现己不常用。下面介绍硬板 的制备方法。（1）薄层板的选择 薄层板应选择表面光滑、平整、洁净，厚 度一致的玻璃板、塑料板或铝箔。薄层板大小可根据实验需要选择， 如：载玻片，20cm x 20cm 玻片等。（2）薄层板的涂布 将固定相、粘合剂和水按一定比例混合， 研磨至均匀且无气泡，即得到固定相匀浆。将固定相匀浆涂铺在准备 好的薄层板上，使整板涂布均匀，一般厚度以250为宜。薄层厚 度及均匀性直接影响试样分离效果和Rf值的重复性。（3）薄层板的活化 涂铺的薄层板自然晾干后，在105110 c 活化0.51h,取出，冷却至室温，存放在干燥器中。用聚酰胺吸附 剂铺成的薄

25、层板则需要保存在有一定湿度的空气中。常用的粘合剂有竣甲基纤维素钠（CMC-Na ）和煨石膏（CaSO4? 1/2H2。）。用CMC-Na为粘合剂制成的薄层板称为硅胶-CMC 板。这 种板机械强度好，但在使用强腐蚀性显色试剂时，要掌握好显色温度 和时间，以免CMC-Na炭化而影响检测。用煨石膏为粘合剂制成的薄 层板称为硅胶-G板。这种板机械强度较差，易脱落。在分离酸性或碱性化合物时，可制备酸性或碱性薄层来改善分离 效果。如在硅胶中加入碱或碱性缓冲液制成碱性薄层，可分离生物碱 等碱性化合物。除手工制板外，还可以用自动机械铺板器制板。用铺板器制板速 度快，薄层厚度均匀，重现性好，定量分析结果可靠。此

26、外，还有商 品薄板可供选择。（二）点样点样（spotting）是薄层色谱分离的重要步骤。选择适当溶剂，将试 样配制成浓度为0.01%0.1%的溶液。溶剂一般选用乙醇、甲醇等易挥 发性有机溶剂，避免使用水，因为水溶液斑点易扩散，且不易挥发除 去。点样工具一般采用点样毛细管或微量注射器。点样原点直径以 24mm为宜，采用分量多次点样，每次点样需自然干燥或用电吹风干 燥后，才能二次点样，以免斑点扩散。点样量一般以几微升为宜，若 进行薄层定量或薄层制备时，可多至几百微升。点样形状可以是点状， 也可以是带状。自动点样仪可进行程序控制点样。在进行薄层定量时，原点直径的一致，点样间距的精确，是保证 定量精确

27、度的关键。（三）展开展开（development ）过程使用 的器皿一般为长方 形密闭玻璃缸， 称为层析缸或色谱缸。将薄层板直立于盛有展开剂的色谱缸中，展开 剂浸没薄板下端的高度不超过0.5cm,原点不得浸入展开剂中。展开 剂借助毛细管作用向上展开，待展开剂前沿达一定距离（如1020cm ） 时，将薄层板取出，标记溶剂前沿。在展开之前，薄层板置于盛有展开剂的色谱缸内饱和1530分钟， 此时薄板不与展开剂直接接触。待色谱缸内展开剂蒸气、薄层、缸内 大气达到动态平衡时，体系达到饱和，再将薄层板浸入展开剂中。预 饱和可以避免边缘效应。边缘效应是同一组分在同一板上处于边缘斑 点的Rf比处于中心的Rf值

28、大的现象。产生边缘效应的原因是由于展 开剂的蒸发速度从薄层中央到两边缘逐渐增加，即处于边缘的溶剂挥 发速度较快。在相同条件下，致使同一组分在边缘的迁移距离大于在 中心的迁移距离。薄层展开常用上行法，另外还有下行法（展开剂从上向下展开）、 径向展开（展开剂由原点径向展开）、多次展开 （同一展开剂，重复 多次展开）、双向展开（展开一次后，转90°用另一展开剂展开）。选 用自动多次展开仪，可进行程序多次展开。（四）斑点的确定为了对薄层分离的组分进行定性、定量分析，必须对从层析缸中 取出的薄层板上的斑点进行定位。斑点位置确定的方法有：（ 1） 在日光下观察， 画出有色物质的斑点位置。（ 2）

29、 在 紫 外 灯 （ 254nm 或 365nm ） 下 观 察 有 无 暗 斑 或 荧 光 斑 点 ， 并记录其颜色、位置及强弱。能发荧光的物质或少数有紫外吸收的物 质可用此法检出。（ 3） 在 254nm 紫 外 灯 下 ， 掺 入 了 少 量 荧 光 物 质 的 薄 层 板 呈 黄 绿 色荧光，被测组分在荧光薄层板上淬灭荧光而产生暗斑进行检出。（ 4） 利 用 显 色 剂 显 色 斑 点 。 薄 层 色 谱 常 用 的 通 用 型 显 色 剂 有 碘 、 硫酸溶液和荧光黄溶液等。碘蒸气对许多有机化合物都可显色，如 生物碱、氨基酸衍生物、肽类、脂类、皂甙类等。该显色反应是可逆 的，在空气随

30、着碘的升华挥发，组分斑点可回复到原来状态。10% 硫酸乙醇溶液使大多数有机化合物产生有色斑点，如红色、棕色、紫 色等 ， 甚 至于 出 现荧 光。 0.05% 荧光黄 甲 醇溶液是芳香族与杂环化 合物的通用显色剂。四、 定性和定量分析（一）定性分析1. 比 移 值 Rf 定 性 在 一定 色 谱 条件 下 ， 某一 组 分 的 Rf 值 是一 定 值 ，可 用 于 定 性 分 析 。但 是 绝 对 比 移 值 Rf 影 响 因 素 很 多 ，如 吸 附 剂 的 种类和活度、展开剂的种类和极性、薄层厚度、展开距离、色谱容器 内 溶 剂蒸气的 饱和程度 、温 度等 ，因 此与 文 献收 载 的 R

31、f 值 比 较进行组 分定性困难较大。常用的方法是将试样与对照品在同一块薄层板上展 开 ，根 据 试 样 和 对 照 品 的 Rf 值 及 其 斑 点 颜 色 比 较 进 行 定 性 。必 要 时 可 经过 多种 展开 系 统 ，样 品 的 Rf 值及其斑 点 颜色与 对照 品 比 较 ，进 一 步 认定该组分与对照品是同一化合物2. 相 对 比 移 值 Rr 定 性 组 分 的 Rr 值 定 性 比 Rf 值 可 靠 的 多 。 可 采 用与文献收载的Rr值比较进行定性，也可与对照品的Rr值比较进行 定性。此外利用斑点与显色剂反应生成的有色斑点也可初步推断化合物 的类型。（二）杂质检查薄层色

32、谱可用于药品中有关物质的检查和杂质限量的检查。1 .杂质对 照品比较法 配制一定浓度的试样溶液和规定 限定浓度 的杂质对照品溶液，在同一薄层板上展开，试样中杂质斑点颜色不得 比杂质对照品斑点颜色深。2 . 主 成分 自 身 对 照 法 首 先配 制 一 定浓 度 的 供 试 品 溶液 ， 然后 将 其稀释一定倍数得到另一低浓度溶液，作为对照溶液。将试样溶液和 对照溶液在同一薄层板上展开，试样溶液中杂质斑点颜色不得比对照 溶液主斑点颜色深。例 19-1 硫 酸 长 春 碱 的 杂 质 检 查 （ 中 国 药 典 2005 年 版 ） 。取硫酸长 春碱用 甲 醇制成 10mg/ml 的 溶液 ，作

33、 为供试 品溶液 ；精 密量 取适量 ， 用 甲 醇稀释成 0.20mg/ml 的 溶液 ， 作 为对 照 溶液 。 吸 取 上述两种溶液各5屋，分别在同一 GF 254薄层板上点样，用石油醴（沸 程 3060 ） 氯仿 丙酮 二乙 胺（12: 6: 1: 1） 为展开剂 ，展开 ， 晾干。 在 254nm 紫 外 灯 下 检 测 。 供 试 品 溶 液 如 显 杂 质 斑 点 ， 不 得 超 过 2 个 ， 其颜色与对照溶液的主斑点比较，不得更深。（三）定量分析1 洗 脱 法 试 样 经 薄 层 色 谱 分 离 后 ，选 用 合 适 溶 剂 将 斑 点 中 的 组 分洗脱下来，再用适当的方法

34、进行定量测定。斑点需预先定位。采用 显色剂定位时，可在试样两边同时点上待测组分的对照品作为定位标 记，展开后只对两边对照品喷洒显色剂，由对照品斑点位置来确定未 显色的试样待测斑点的位置。2 直 接 定 量 法 试 样 经 薄 层 色 谱 分 离 后 ， 可 在 薄 层 板 上 对 斑 点 进 行直接测定。（1）目视比较法：将一系列己知浓度的对照品溶液与试样溶液点 在同一薄层板上，展开并显色后，以目视法直接比较试样斑点与对照 品斑点的颜色深度或面积大小，求出被测组分的近似含量，作为半定 量方法，精密度为土 10%。（2）薄层扫描法：用薄层扫描仪对薄层板上斑点进行扫描，通过 斑点对光产生吸收的强弱

35、进行定量分析。该法精密度可达±5%。五、高效薄层色谱法高 效薄层 色谱法（high peformance thin layer chromatography ；HPTLC ） 是在现代色谱理论指导下，以经典薄层色谱法为基础发展 起来的一种新型薄层色谱技术。高效薄层色谱法与经典薄层色谱法相 比，具有分离效率高，分析速度快，检测灵敏度高等特点。高效薄层 色谱法与经典薄层色谱法比较见表19-3 。表19-3 TLC 与HPTLC 的比较参数TLCHPTLC板尺寸（cm）20X2010X 10颗粒直径（师）10405,10颗粒分布宽窄点样量（/）150.10.2原点直径（mm）3611.5展

36、开后斑点直径（mm）61525有效塔板数> 600> 5000有效板高（师）3012分离数1020点样数101836展开距离（cm）101536展开时间（min）30200320± 50.10.5510精密度RSD（%）± 10最小检测量：吸收（ng）15荧光（pg）501001 .高效薄层板 高效薄层板是由颗粒直径小且均匀的固定相，采 用喷雾技术制成的高度均匀的薄板。一般为商品预制板，常用的有硅 胶、氧化铝、纤维素和化学键合相薄层板。商品预制板厚度均匀，使 用方便，适用于定量测定。从表19-2中可知，由于高效薄层板使用了 颗粒直径小，分布窄且均匀的吸附剂，使展

37、开过程的流动相流速慢， 容易达平衡，传质阻抗较小，得到的斑点小、圆而整齐。从而使HPTLC 具有分离度好，灵敏度高，分析时间短等特点。2 .点样 高效薄层色谱展距短，要实现高的分离效率必须使展开 后的斑点很小。为此，要求点样直径必须小，但点样直径太小易造成 样品局部过浓，反而产生拖尾，分离效率降低。所以点样时应尽可能 采用浓溶液一次点样。高效薄层色谱法采用的点样器有铝-钺合金点样 毛细管、微量注射器或专用点样仪器。3 .展开 高效薄层色谱法的展开可采用与经典薄层色谱法相同 的展开方式。目前已生产出专用的高效薄层色谱展开槽，能严格控制 分离条件，从而获得重现性较好的分离结果。4 .定量分析高效薄

38、层色谱法均采用薄层扫描仪进行定量分析。 由于高效薄层板的吸附剂颗粒小，涂铺均匀，因此进行薄层扫描时基 线稳定，板间误差较小，重现性较好。由于点样量小，得到的斑点小、 均匀而整齐，因此扫描得到的标准曲线线性较好，准确度较高。六、薄层扫描法简介（一）薄层扫描法基本原理薄层扫描法是以一定强度波长的光照射薄层板上被分离组分的斑 点，测定斑点对光吸收的强度或发出荧光强度，进行定量分析的方法。 薄层扫描仪的种类很多，常用的是双波长薄层扫描仪，它的特点是对 斑点曲折扫描，双波长进行反射法、透射法测定图19-4为双波长薄层扫描仪的示意图。从光源（笊灯或鸨灯）发 射的光，通过两个单色器MR和MS分光后形成两束不

39、同波长的光加 （参比波长）和%（测定波长）。由于斩光器的遮断，两束光交替通过 斩光器并穿过狭缝，通过反光镜照在薄层板上，如为反射法测定，则 斑点表面的反射光由光电倍增管PMR接收；如为透射法测定，则由 PMT光电倍增管接收。用 加和两种不同波长光交替照射斑点，测 定两波长的吸光度的差值，从而进行含量测定。此外，还可用荧光扫 描法测定（用氤灯为光源）。图19-4双波长型薄层扫描仪示意图1 .测定波长与参比波长加的选择 人选择斑点中被测组分的最 大吸收波长，至一般选择被测组分吸收曲线的吸收峰邻近基线处的波 长，即选用不被被测组分吸收的波长，在此波长下，所测的值为薄层 板的空白吸收。双波长法由于从测

40、量值中减去了薄层本身的空白吸收， 所以在一定程度上消除了薄层不均匀的影响，使测定结果准确度提高。2 .薄层扫描方法（1）透射法：光源发出的光，经单色器分光后得到的单色光交替 照射在薄层斑点上和空白薄层上，测定透射光的强度。光源和检测器 在薄层板的两测（见图19-5a）。空白薄层透光率T0 = i0 ,斑点透光率iT =1,被测组分斑点吸光度：I 0A = Tg（"）=lg（T°）（ 19-11 ）式中I0为入射光强度，i0为空白薄层板透射光强度，i为斑点透射 光强度。透射法光强度大，但受薄层厚度、均匀度等影响较大。此外，玻 璃板不透过紫外光。因此实际应用受到一定的限制。（2

41、）反射法：光源发出的光，经单色器分光后得到的单色光交替照射在薄层斑点上和空白薄层上，测定反射光的强度。光源和检测器在薄层板的同侧（见图19-5b）。空白薄层反射率R0=ji斑点反射率0 I0，R=j,被测组分斑点吸光度： I 0(19-12 )RRnA = Tg( ) =lg( )RoR式中jo为空白薄层板反射光强度，j为斑点反射光强度。反射法重现性较好，基线稳定，受薄层厚度、均匀度等影响较小， 但光强度小。在实际工作中常用反射法。图19-5 透射法和反射法示意图 |bI 0ii0目前，薄层扫描仪都是光源不动，只移动薄层板，扫描方式可分 线形扫描及曲折形扫描两种。线形扫描速度快，但在斑点形状不

42、规则 和浓度不均匀时，测量误差较大。荧光测定时一定要用线形扫描。曲 折扫描是将光束缩小到光束内斑点浓度变化可以忽略的程度，进行一 个方向的移动扫描及另一垂直方向的往复扫描，适用于形状不规则及 浓度分布不均匀的斑点。3 .散射参数的选择一一非线性关系的校正 因颗粒状吸附剂对光 有强烈的散射作用，使斑点中组分的吸光度与其量不成线性关系，即 不遵守比尔定律。为了准确地进行定量分析，必需将曲线校正为直线。 曲线校正是在实验前根据薄层板的类型，选择合适的散射参数（SX）, 由计算机根据适当的修正程序，自动进行校正。曲线校直后方可进行 定量分析。岛津薄层扫描仪一般设有110个散射参数，硅胶薄层板 SX 一

43、股选用3,氧化铝薄层板选7,进行定量分析。4 定 量 分 析 法 薄 层 扫 描 定 量 分 析 主 要 采 用 外 标 法 ，即 先 用 被 测 组分对照品浓度系列作校正曲线，得到线性范围，进行含量测定。在 实际工作中常采用外标一点法和外标两点法（见第十七章 气相色谱 法）。薄层色谱广泛应用于中药和中成药有效成分鉴别，含量测定。同 时，薄层色谱法还应用于各种天然和合成有机物的分离和鉴定，有时 也用于小量物质的精制。在生产上可用于判断反应的终点，监视反应 过程等。第三节纸色谱法一、 纸色谱法的分离原理纸色谱法是以纸为载体的平面色谱法。纸色谱过程可以看成是溶 质在固定相和流动相之间连续萃取的过程

44、。依据溶质在两相间分配系 数的不同而达到分离的目的。所以纸色谱法分离原理属于分配色谱的 范畴 。与 薄层 色 谱 相 同 ，纸 色谱也 常用 比移 值 Rf 来表示 各组 分在色 谱 中位置。纸色谱中化合物在两相中的分配系数与化合物的分子结构及流动 相种类和极性有关，纸色谱属于正相分配色谱。当流动相一定时，化 合物的极性越大或亲水性越强，分配系数越大，Rf值越小；化合物极 性越小或亲脂性越强，分配系数越小，Rf值越大。当化合物一定时， 流动 相 极性越 大 ，化 合 物分配 系 数越小 ， Rf 值越 大 ；流 动 相极性越小 ， 分配系数越大，Rf值越小。Rf值与分配系数或保留因子的关系符合

45、第 一节推导的两者的关系式。化合物的极性应根据整个分子及组成分子 的各个基团的极性来考虑。同类化合物中含极性基团多的化合物通常 极性较强。例如同属于六碳糖的葡萄糖，鼠李糖和洋地黄毒糖在同一 条件下，Rf值是不相同的。一些数据列于表19-4。可以看出，葡萄糖 的羟基最多 ， 极性最强 ， Rf 值最小， 洋地黄毒糖分子的极性最小， Rf 值最大。表19-4 三种六碳糖的Rf值溶剂系统六碳糖羟基数目正丁醇-水正丁醇-酸-水Rf（4:1:5） Rf乙酸乙酯-口比咤-水（25:10:35） Rf葡萄糖50.030.170.10鼠李唐40.270.420.44洋地黄毒糖30.580.660.88CHOC

46、HOCHO|HC OH HO-CHCH2|HO-CH1HO-CHHC-OHHC-OHHC-OHHC-OHHC-OHHC-OHHC-OHCH2OHCH3CH3葡萄糖鼠李唐洋地黄毒糖纸色谱的实验条件1 .色谱纸的选择 （1）要求滤纸质地均匀，平整无折痕，有一 定的机械强度。（2）纸纤维的松紧适宜，过于疏松易使斑点扩散，过 于紧密则流速太慢。（3）纸质要纯，无明显的荧光斑点。（4）对Rf 值相差较小的化合物，选用慢速滤纸；Rf值相差较大的化合物，选用 快速滤纸。（5）进行制备或定量分析时，可选用载样量大的厚纸；进 行定性分析时一般可选用薄纸。常用的国产滤纸有新华滤纸，进口滤 纸有 Whatman 滤

47、纸。2 .固定相 滤纸纤维有较强的吸湿性，通常含20%25%的水分， 而其中有6%7%的水是以氢键缔合的形式与纤维素上的羟基结合在 一起，在一般条件下较难脱去。所以纸色谱法实际上是以吸着在纤维 素上的水作固定相，而纸纤维则是起到一个惰性载体的作用。有时为了适应某些特殊要求，可对滤纸进行特殊处理。如分离具有酸碱性物 质时 ， 为了维持 滤纸相对稳定的酸碱性 ， 可将滤纸在一定 pH 缓冲溶 液中浸渍处理后使用。如分离弱极性物质时，为了增加其在固定相中 的溶 解度 ，获 得理想 的 Rf 值 ，并 使组分分离 ，可 将滤纸在 一定 浓度 的 甲酰胺、二甲基甲酰胺、丙二醇溶液中浸渍，以降低固定相的极性。3 展 开剂 的 选择 展 开剂 的 选 择要 根 据欲 分 离 物 质 在 两 相 中 的 溶 解度和展开剂的极性来考虑。在流动相中的溶解度较大的物质将会移 动得 快 ，因 而 具有较大 的 Rf 值 。对 极性 物 质 ，增 加 展开剂 中 极 性溶 剂 的 比 例 ，可 以 增大 Rf 值 ；增 加 展 开剂 中非 极 性 溶剂 的 比 例 ，