肺出血模型研究进展

1、肺出血动物模型的研究进展 专业 姓名 学号摘要：肺出血，又称肺出血-肾炎综合征（Goodpastures syndrome，GPS）可能系病毒感染和/或吸入某些化学性物质引起原发性肺损害。由于肺泡壁毛细血管基膜和肾小球基底膜存在交叉反应抗原，故可以引起继发性肾损伤。明确的病因尚未证实，但多推测和感染特别是病毒感染有关。其主要特征为咯血肺部浸润、肾小球肾炎、血和累及的组织中有抗基底膜抗体。本病虽然临床少见，但死亡率高，多发于2030岁的男性青年。本文将介绍几种构建肺出血实验动物模型的方法。关键词：肺出血， 肺出血-肾炎综合征， 实验动物模型The research progress about

2、animal models of Goodpastures syndromeAbstract：Goodpastures syndrome may be caused by viral infection and inhalation of certain chemical substances. It can cause secondary renal injury due to the cross-reactive antigens between alveolar wall capillary basement membrane and glomerular basement membra

3、ne. The explicitly nosogenesis hasnt been proved，but we conjecture that it is related to infect especially virus infected. Its main features are hemoptysis, lung infiltration, glomerular nephritis, blood and the organization involving in anti-basement membrane antibodies. Though it is uncommon in th

4、e clinical, its mortality rate is high. It mostly occurs in twenty to thirty male young people.This paper summarizes the current several animal models of Goodpastures syndrome.Key words: Goodpastures syndrome, animal models1 疾病简介1.1 疾病表现肺出血-肾炎综合征(Goodpastures syndrome,GPS)又称抗基膜性肾小球肾炎，1919年由Goodpastu

5、re首先描述男性病患一例，1958年Stanton和Tange正式将此类疾病名为Goodpastures syndrome，它是以肺出血和急进型肾炎为特征的一种综合征，与自身免疫有关，临床少见 【1】。其主要临床表现为咯血和急进性肾炎；肾（肺）活检免疫荧光检查显示肾小球基底膜或（和）肺毛细血管基底膜LgG、G3线样沉积；血清抗肾小球基底膜抗体阳性；影像学上主要表现为中下肺野中外带腺泡结【2】。X线检查见两肺有弥漫性或结节状阴影，自肺门向周围扩散，肺尖及近膈肌处清晰，常一侧较重，有的无咯血史，但经痰含铁血黄素及胸片检查证实有出血。免疫荧光检查显示肺泡间隔和肺毛细血管基膜有免疫球蛋白和C3呈线状沉

6、积。1.2 病因GPS的发病机理不甚明确，一般认为其可能系病毒感染和/或吸入某些化学性物质引起的原发性肺损害。有学者认为与以下因素有关： 1.2.1 感染   呼吸道感染，特别与流感病毒感染是本病最常见的诱因。最近研究发现获得性免疫缺陷病患者感染卡氏肺囊虫肺炎(Pneumocystis Carinii Pneumonia)后，机体易产生抗GBM抗体。Calderon等报道4例HIV感染者中3例抗型胶原3链抗体(抗GBM抗体)阳性，提示卡氏肺囊虫肺炎时肺泡损害可以诱发肺出血-肾炎综合征。1.2.2 接触汽油蒸汽、羟化物、松节油及吸入各种

7、碳氢化合物。【2】1.2.3 吸入可卡因   Perez等报道1例长期吸烟的患者在吸用可卡因3周以后发生了肺出血一肾炎综合征。 GPS临床上并不常见，其发病率约为每年0.10.5/100万人，占急进型肾小球肾炎病例的1%2%，可发生于任何年龄,但以青年男性多见,平均年龄2126.8岁,男女比例约为3.691。我国自1965年首例报道以来，据不完全统计已有100余例见诸报道。【3】在临床上，新生儿肺出血(neonatal pulmonary hemorrhage，NPI)的发病率要远高于GPS。NPI是指肺部累积两个肺叶以上的出血，是新生儿期病情非常凶险、

8、发展极快的一种危重疾病，它是新生儿严重呼吸系统并发症，是新生儿期死亡的重要原因之一。【4】目前尚无特效治疗措施，病死率极高。新生儿肺出血的病因很多，包括低温、缺氧及感染等，但其确切发病机制至今尚未阐明。【5】2 造模方法目前构建肺出血实验动物模型的方法很多，但是多数多是模拟新生儿肺出血发病机制，对新生儿肺出血进行研究。在研究过程中，我们将肉眼观察肺出血情况的结果分成5 级：I级正常肺；II级肺水肿； III级点状肺出血；IV级局灶性肺出血；V级弥漫性肺出血【6】。现将模型制作方法介绍如下。2.1低温缺氧造模方法【6】2.1.1方法采用出生47d的Wistar新生大鼠40只, 随机4组。A组为正

9、常对照组, 置于25恒温环境中。其余大鼠放入氧浓度为5% 6%的有机玻璃箱内, 并将该箱放入(10±1)冰箱中。按置放时间分为: 低温缺氧1h组(B组);低温缺氧2h组(C组);低温缺氧4h组( D 组) , 将此3组新生大鼠分别于1, 2, 4 h 后取出并迅速放入置于水浴箱中的有机玻璃箱内, 维持箱37, 供氧使箱内氧浓度达99. 5% 100%, 3 组均持续2 h。断头法处死动物, 肉眼观察肺出血情况。2.1.2建模结果结果病理分级如下：具体病理改变为光镜下见部分肺泡含气不全,部分肺泡代偿性扩张,肺泡腔内有较多水肿液和红细胞,肺泡间隔明显水肿;部分细支气管腔内可见水肿液及坏死

10、脱落细胞;毛细血管中度充血。电镜下毛细血管内皮细胞中度肿胀,异染色质增多、边聚,血管腔变窄,部分基底膜变薄或中断,肺泡间隔可见红细胞;II型上皮细胞及其中的线粒体均肿胀,嵴模糊,板层小体数目减少,可见排空现象, 肺泡面微绒毛减少,但上皮细胞之间紧密连接尚无异常。2.1.3模型特点肉眼观察均有不同成度的肺出血，其中弥漫性肺出血多表现为全肺各叶的大片出血。本动物模型的制作具有一定的合理性及可重复性,便于开展对肺出血发病机制的研究,尽管模型的制作对临床给予了一些启示,但低温缺氧后再复温供氧所致肺出血的机理,尚需进一步研究。2.2五羟色胺气管滴入造模方法【7】2.2.1方法将动物编号秤重后，取仰卧位固

11、定，剪开颈部皮肤，暴露气管，将接有水柱的小号套管针插入气管5mm，拔出针芯，看到水柱随呼吸上下波动即表示进入气管；动物分别取右侧卧及头高位体位，用移液器将生理盐水及不同浓度5-HT 20ul的注入气管。2.2.2 结果具体的浓度及实验结果如下：光镜观察结果如下：正常肺脏组织局灶性肺出血肺组织点状肺出血肺组织 弥漫性肺出血肺组织由数据统计和光镜观察结果所知，通过外源性5-HT气管滴入可以建立新生大鼠的肺出血动物模型，以浓度1*10-5mol/L较为适宜，随着5-HT浓度增加，大鼠死亡率增加，但肺出血的程度无显著差异。2.2.3模型特点本模型制作简便，重复性好，其中弥漫性肺出血占10% 15%便于

12、在此基础上进行有关肺出血的进一步研究。2.3注射IV型胶原3链抗体造模方法【8】2.3.1方法采用体重150g180gWistar-Kyoto(WKY)大鼠。从牛肾小球基底膜组织分离IV胶原六聚体，然后分解为单体和二聚体。然后将制备好的注射物不同剂量的制备物分别注射给大鼠，进行观察；7天后再次注射，15天后观察结果。2.3.2结果注射单体胶原的大鼠无明显结果，注射二聚体和六聚体的大鼠可见明显的肺出血，在尿液中可检测到尿蛋白，在肾小球基底膜可发现线性IgG。牛3(IV)NC1A二聚体免疫后大鼠肺组织。A.对照组大鼠正常的肺组织切片(HE,×150)。B. 20ug 3(IV)NC1二聚

13、体免疫后大鼠肺组织，可见局灶出血和肺泡壁增厚（PAS染色×150）。C. 50ug 3(IV)NC1二聚体免疫后大鼠肺组织，可见肺泡中有红细胞（HE染色×300）。D. 50ug 3(IV)NC1二聚体免疫后大鼠肺组织，可见红细胞和含铁血黄素沉着。右下角小图可见巨噬细胞内含含铁血黄素。（Gomoris Prussian Blue染色×300，右下角×800）。2.4腹腔注射脂多糖造模方法【9】 2.4.1方法该方法模拟的是有感染引起的肺出血。选择新生Wistar大鼠，日龄7天，体重12到18克，共88只。将88只大鼠随机分成8组，分别为生理盐水对照组（8

14、只）, LPS 注射后30min 组（8只）,1 h 组（8只）, 2 h 组（8只）, 4 h 组（8只）, 8 h 组（8只），16 h 组(16只) , 24 h 组(24只)。腹腔注射脂多糖，剂量为5 mg/ kg。注射后病理分级如下：2.4.2结果其中16 h 组死亡8 只, 24 h 组死亡17 只。所有存活动物按设定时间断头处死, 立即打开胸腔, 右肺上叶作光镜及电镜病理检查。肺组织大体病理改变为:LPS 注射后0.5 h 肺组织即可见点状肺出血, 给药后1 8 h, 肺出血的程度自局灶性到弥漫性逐渐加重, 大鼠发生肺出血的数量也逐渐增多。光镜检查显示，随着肺组织从正常到弥漫性肺

15、出血发展, 光镜下可见肺组织毛细血管充血, 少量出血到弥漫性出血, 肺泡腔内红细胞逐渐增多, 到给药后48 h, 肺泡腔及间质内可见大量的红细胞, 但未见明显的中性粒细胞浸润。给药后16 h, 肺泡腔内可见较多的中性粒细胞及少量的巨噬细胞, 给药后24 h, 肺组织内可见大量的中性粒细胞。透射电镜显示正常新生大鼠肺组织可见毛细血管内皮细胞连续, 基膜完整。随着给药后时间的延长, 正常结构已破坏。给药后4 8 h 改变最严重, 可见毛细血管内皮细胞线粒体空泡变性, 内皮细胞间胞膜不连续, 细胞间连接消失, 基膜变薄, 断裂, 气血屏障破损。2.4.3模型特点此模型病理改变与新生儿肺出血的病理改变

16、相似，在早期, 是否发生一过性肺毛细血管内压力的增加而引起的机械性肺损伤, 尚待进一步研究。2.5 皮下注射肾上腺素造模方法【10】2.5.1方法选用一月龄SD大鼠24只，雌雄不限，随机分成两组。实验组大鼠背部注射0.1%肾上腺素注射液，每日2次，第一天剂量每次0.2mg/kg，第二天每次0.3mg/kg，以此逐渐增加至第七天0.8mg/kg（体重以第一天称量为准）。对照组大鼠相同部位同等容量生理盐水，每日两次。实验组大鼠死后便立即处死，解剖观察，病理分级如下：2.5.2结果电镜结果如图：A：肺气泡扩张，充满红细胞 B：I型上皮局部崩溃C：II型细胞板层小体空泡化，线粒体肿胀，绒毛减少 D：毛

17、细血管扩张充血，充气，气血屏障变薄，可见气血屏障全层断链，红细胞即将逃逸出毛细血管2.5.3 模型特点该模型是模拟临床先天性心脏病, 超量输液致严重肺血管充血导致的新生儿肺出血。本模型的制作具有一定的合理性和可重复性, 便于开展对肺出血的研究, 但实验时间偏长,有待改进。2.6注射钩端螺旋体培养液造模方法【11】2.6.1方法采用体重150500g健康豚鼠。将豚鼠左侧腹部被毛剪去一块，常规消毒，每只豚鼠腹壁皮下注射017黄疸出血型钩端螺旋体的培养混悬液（每只×40视野含2040条，由四川医学院钩端螺旋体病防治研究实验室培养成功）0.20.4ml，进行感染。可使100%的豚鼠复制有肺出

18、血，30%的豚鼠有黄疸。2.6.2结果感染后肺出血呈渐进性变化，最初仅针尖大小，以后发展成为斑块或大叶。出血灶的扩延有直接扩大、点灶融合及沿支气管腔蔓延等多种方式。出血灶绝大多数分布于脏层膜下浅表部位，仅晚期才蔓延到深部。感染57d，血小板计数减少，血块不收缩，心电图出现QT延长，心动过缓心肌糖原减少，心肌出血，同时血管脆性增加，肺出血严重。少数豚鼠表现全肺出血，死时口鼻流出少量血液。2.6.3模型特点该模型可用于弥漫型肺出血发病机理和抢救措施比较系统的研究。2.7冲击伤和烧伤复合伤【12】2.7.1方法用体重180到220克的雄性Wistar大鼠，随机分为冲击伤组、烧伤组和烧冲复合组，冲击伤

19、后15min内速发死亡大鼠另列一组。以BST-1型生物激波管致冲击伤, 冲击波超压峰值为429.3±11.5KPa，正压作用时间55到60ms，负压40.8 KPa，持续约20ms。冲后用5KW溴钨灯致体表15%III度烧伤, 单烧组只造成15%III度烧伤。于伤后2、12、24、72和168h各组分别麻醉活杀5只, 取出心肺，固定切片观察。2.7.2结果本实验速发死亡大鼠除肺脏外无肉眼可见的其它脏器损伤, 平均肺出血体积占全肺96.3 % , 水肿多位于出血区边缘组织, 单纯肺水肿较少。严重肺水肿只见于稍晚(> 0.5 h)死亡的动物。因此严重肺出血是致死的主要原因。2.7.

20、3模型特点肺是冲击伤时最易受损的靶器官之一,在以超压为主的冲击波作用下, 损伤尤为突出。肺出血是肺损伤的最主要病变，所以可以用冲击伤又发肺心病。核爆炸冲击伤由动压和超压作用所致，肺脏病理变化表现为出血、水肿、破裂、血气泡形成、局部肺泡萎陷或扩张。本实验模拟核爆炸时的冲击伤造成的肺出血，对其进行研究，但是动物在受伤即刻或数分钟内形成如此广泛而严重的肺出血, 其机理值得进一步研究。2.8注射兔抗大鼠肺脏血清造模方法【13】这种造模方法比较特别，首先是将大鼠肺脏的不溶提取物（球蛋白检测呈阴性）用生理盐水稀释后注射入家兔体内，6到13周后耳静脉采血提血清，然后将阳性血清注入大鼠体内，四周后处死大鼠观察

21、肺脏的病变情况。结果显示肺脏出现明显的肿胀和出血，肾脏也出现不同程度的损伤。在当时，这个实验证明了一个假说，有些器官病变是由于自身的免疫失调造成的。虽然这种造模方法比较复杂，但是其结果比较显著，是研究自身免疫造成的肺心病的较优模型。2.9外源性内皮素-1(exET-1)致肺出血造模方法【14】2.9.1方法Wistar新生大鼠100只,日龄45 d,体重810 g,雌雄不限。随机分为对照组A组10只,实验组90只中分为B、C、D、E 4组各20只、F组10只,每组动物间体重无差异。经气管插管于气管内滴入生理盐水(对照组)及不同浓度exET-1(实验组)各30l。 A组滴生理盐水,BF组滴exE

22、T-1,浓度分别为2×10-6,3×10-6,4×10-6,5×10-6及10×10-6 (单位均为mol/L)。2.9.2结果注入药液3 h后处死动物,取出双侧肺脏,观察肺组织大体病理及用10%中性福尔马林固定24 h,石蜡包埋后HE染色,光镜观察。肺出血发生率(包括点状、局灶及弥漫)从B组的40%(8/20)升至D组的80%(16/20),弥漫性肺出血数量亦逐渐增加,其中D组肺出血最严重,但E及F组肺出血发生率反降至50%(10/20)及20%(2/10)。exET-1浓度3×10-6mol/L时新生大鼠无死亡,浓度>3&#

23、215;10-6mol/L时,死亡率从D组的20%(4/20)升至F组的60%(6/10),经统计学分析，结果表明,exET-1气管内滴入可致肺出血:B、C、D、E、F各组肺出血病变均重于正常对照组(P均<0.05),D组(4×10-6mol/L exET-1)又重于B、C、E、F各组(P均<0.05),而该4组间差异无显著意义(P均>0.05)。尽管随exET-1浓度的增加,死亡率上升,但死亡大鼠病变程度不同,D组以局灶及弥漫性肺出血为多,E及F组则以肺水肿及点状出血为主,且后两组存活大鼠肺出血程度亦较轻。2.9.3模型特点采用exET-1气管内滴入,可建立新生大

24、鼠肺出血动物模型,并在一定浓度范围内,随exET-1浓度的增加,肺出血加重。其中D组肺出血程度最重,提示肺组织中内源性ET-1水平异常升高,也可能是导致肺出血的原因之一。此外,存活大鼠紫绀以滴入exET-1后30 min最严重,符合内源性ET-1在(1530)min达最大血管收缩效应的特点。3展望由于肺出血的致病因素很多，关于肺出血的模型也很多。在这些模型当中，低温缺氧造模方法，腹腔注射脂多糖法，皮下注射肾上腺素法，注射IV型胶原3链抗体法，这四种方法操作简便，对动物造成的痛苦较其它方法要小，但是后两种方法时间长，有待改进。五羟色胺气管滴入造模法造模时间短，可重复性好，在实验过程中注意对动物的

25、麻醉及手术处理。本文所介绍的这些模型均模拟的是一种因素短时间的影响，而临床上肺出血往往是由于一种因素长时间作用或几种因素共同作用的结果。所以，怎样合理有效的在实验室内建立更符合临床特点的肺出血模型有待进一步研究。据有些医院临床检查情况来看，有些肺出血患者有长期接触汽油蒸汽、羟化物、松节油及吸入各种碳氢化合物的情况，因此可以使动物通过吸入有这类物质的空气来建立肺出血-肾炎综合征的疾病模型，更详细的研究疾病发病机理和发病过程。参考文献【1】 苗姝，孙延翁等. 肺出血-肾炎综合征1例报告并文献复习. 中国误诊学杂志2004年7月第4卷第7期【2】 解放军肾脏病研究所学术委员会.肾脏病与透析移植杂志.2006年8月第15卷第4期【3】刘昭红，廖谷清. 肺出血肾炎综合征2例并文献复习. 临床医学2004年10月第24卷第10期【4