CTAB法提取植物叶片月农学院学习课程

1、一、核酸分离纯化的前处理1、材料的选择与预处理R 选择含量高、来源丰富、易获得、制备工艺简单、成本低选择含量高、来源丰富、易获得、制备工艺简单、成本低R 预处理，如动物材料除去预处理，如动物材料除去结缔组织、脂肪组织结缔组织、脂肪组织；植物种子需要；植物种子需要除壳除壳；微生物需要将；微生物需要将菌菌体与发酵液体与发酵液分开。分开。R 另外，必须尽可能保持材料的新鲜，尽快加工处理。若不立即进行实验或加工，应冷另外，必须尽可能保持材料的新鲜，尽快加工处理。若不立即进行实验或加工，应冷冻保存。冻保存。第1页/共43页第一页，编辑于星期五：十五点 二十四分。2、细胞的破碎R动物组织和细胞：电动捣碎机

2、或匀浆器破碎或动物组织和细胞：电动捣碎机或匀浆器破碎或用超声波处理破碎。用超声波处理破碎。R植物组织和细胞：由于具有纤维素、半纤维素植物组织和细胞：由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁，一般常用与石英砂和果胶等物质组成的细胞壁，一般常用与石英砂和适当的提取液一起研磨的方法破碎或用纤维素和适当的提取液一起研磨的方法破碎或用纤维素酶处理也能达到目的。酶处理也能达到目的。R细菌细胞：破碎较困难，因为整个细菌细胞壁细菌细胞：破碎较困难，因为整个细菌细胞壁的骨架实际上是一借共价键连接而成的的骨架实际上是一借共价键连接而成的肽聚糖肽聚糖囊囊状大分子，非常坚韧。破碎的方法常有超声波震状大分子，非

3、常坚韧。破碎的方法常有超声波震荡、与石英砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理（以荡、与石英砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理（以分解肽聚糖）。分解肽聚糖）。第2页/共43页第二页，编辑于星期五：十五点 二十四分。3、核酸的提取方法DNADNA的提取的提取：一般是利用：一般是利用DNA-DNA-核蛋白（核蛋白（DNPDNP）易溶于）易溶于1mol/L NaCl1mol/L NaCl溶液而不溶于溶液而不溶于0.14mol/L NaCl0.14mol/L NaCl溶液。溶液。RNARNA的提取的提取：利用：利用RNA-RNA-核蛋白（核蛋白（RNPRNP）易溶于）易溶于0.14mol/L NaCl0.14mol/

4、L NaCl溶液而不溶于溶液而不溶于1mol/L NaCl1mol/L NaCl溶液的性溶液的性质，先提取得到质，先提取得到RNPRNP。提取得到提取得到DNPDNP或或RNPRNP后，再将蛋白质除去即可得到相应后，再将蛋白质除去即可得到相应的核酸。的核酸。第3页/共43页第三页，编辑于星期五：十五点 二十四分。第4页/共43页第四页，编辑于星期五：十五点 二十四分。 细胞的破碎细胞壁?去除蛋白质核酸的沉淀研磨破碎CTAB、SDS苯酚、氯仿、异戊醇（25：24：1）异丙醇、乙醇三大步骤第5页/共43页第五页，编辑于星期五：十五点 二十四分。去污剂法或有机溶剂法。去污剂法或有机溶剂法。 去污剂法

5、去污剂法是利用是利用SDS等阴离子去污剂与蛋白质带正电等阴离子去污剂与蛋白质带正电荷的侧链结合，从而使核酸与蛋白质分开。然后加入荷的侧链结合，从而使核酸与蛋白质分开。然后加入浓醋酸钾溶液，使浓醋酸钾溶液，使SDS-蛋白质复合物沉淀，并使多余蛋白质复合物沉淀，并使多余的的SDS转化为溶解度小的钾盐而同时沉淀。转化为溶解度小的钾盐而同时沉淀。 有机溶剂法有机溶剂法是利用酚、氯仿的混合液作蛋白质的变性剂，是利用酚、氯仿的混合液作蛋白质的变性剂，当它们与含核酸和蛋白质的水溶液一起振摇时形成乳当它们与含核酸和蛋白质的水溶液一起振摇时形成乳状液，蛋白质因充分接触酚和氯仿而变性，与核酸分状液，蛋白质因充分接

6、触酚和氯仿而变性，与核酸分开。离心后可分为两相，一般上层为含核酸的水相，开。离心后可分为两相，一般上层为含核酸的水相，下层为有机相，交界处是变性凝聚的蛋白质层。最后下层为有机相，交界处是变性凝聚的蛋白质层。最后利用乙醇或异丙醇讲核酸沉淀离心收集即可。利用乙醇或异丙醇讲核酸沉淀离心收集即可。 蛋白质的去除 第6页/共43页第六页，编辑于星期五：十五点 二十四分。二、核酸的分离纯化1 1、粗分级分离 从细胞中提取得到的核酸，常混杂有蛋白质及各种大小的核酸同类物等杂质，可采从细胞中提取得到的核酸，常混杂有蛋白质及各种大小的核酸同类物等杂质，可采用适当方法进行粗提纯。用适当方法进行粗提纯。 粗提纯中，

7、进一步将蛋白质除去粗提纯中，进一步将蛋白质除去, ,可用去污剂或有机溶剂多次反复提取。可用去污剂或有机溶剂多次反复提取。 从从RNARNA除去混杂的除去混杂的DNADNA，可用，可用DNAaseDNAase将将DNADNA降解掉。降解掉。 从从DNADNA中除去混杂的中除去混杂的RNARNA，可用，可用RNAaseRNAase将将RNARNA降解掉。降解掉。第7页/共43页第七页，编辑于星期五：十五点 二十四分。 核酸样品进行精提纯，一般常用超离心、电泳、柱核酸样品进行精提纯，一般常用超离心、电泳、柱层析等方法。层析等方法。 超离心包括速度区带离心、沉降平衡超离心。超离心包括速度区带离心、沉降

8、平衡超离心。 电泳包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖电泳。电泳包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖电泳。 前者凝胶孔径小，适合分离前者凝胶孔径小，适合分离10001000个核苷酸以下的核个核苷酸以下的核酸分子。后者孔径大，适合分离较大的核酸分子。酸分子。后者孔径大，适合分离较大的核酸分子。 柱层析主要有凝胶过滤柱层析、离子交换层析、柱层析主要有凝胶过滤柱层析、离子交换层析、羟基磷灰石柱层析。羟基磷灰石柱层析。2 2、精分级分离第8页/共43页第八页，编辑于星期五：十五点 二十四分。第三节 纯度鉴定 生物大分子经过分离提纯，最后还要鉴定制品的纯度。生物大分子经过分离提纯，最后还要鉴定制品的纯度。 核酸的纯

9、度鉴定一般采用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳，沉降分析和紫外吸收法（核酸的纯度鉴定一般采用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳，沉降分析和紫外吸收法（A260/A280A260/A280）等方）等方法。法。v 同蛋白质一样，核酸纯度鉴定也必须采用同蛋白质一样，核酸纯度鉴定也必须采用2-32-3种方法才能确定。种方法才能确定。第9页/共43页第九页，编辑于星期五：十五点 二十四分。 植物基因组 DNA的提取 琼脂糖凝胶电泳检测第10页/共43页第十页，编辑于星期五：十五点 二十四分。p脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸(DNA)(DNA)、核糖核酸、核糖核酸(RNA)(RNA)p 与蛋白质结合在一起以核蛋白（与

10、蛋白质结合在一起以核蛋白（DNPDNP）的形式存在。）的形式存在。在制备核酸时通常破坏细胞壁及细胞膜来使核蛋白释在制备核酸时通常破坏细胞壁及细胞膜来使核蛋白释放出来。放出来。p植物总植物总DNADNA包括细胞核包括细胞核DNADNA和细胞核外和细胞核外DNA,DNA,前者存在前者存在于细胞核内，后者存在于细胞质中有半自主性复于细胞核内，后者存在于细胞质中有半自主性复制活性的细胞器内，例如线粒体制活性的细胞器内，例如线粒体DNA(mtDNA)DNA(mtDNA)和叶绿和叶绿体体DNA(ctDNA)DNA(ctDNA)。背景知识背景知识核酸的存在形式核酸的存在形式第11页/共43页第十一页，编辑于

11、星期五：十五点 二十四分。p DNA DNA为白色类似石棉样的为白色类似石棉样的纤维状物纤维状物， RNARNA的纯品的纯品呈呈白色粉末或结晶白色粉末或结晶。核酸和核苷酸大都呈酸味。核酸和核苷酸大都呈酸味。p DNADNA、RNARNA和核苷酸都是和核苷酸都是极性化合物极性化合物，一般都溶，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水。比游离酸易溶于水。p 在酸性溶液中，核酸易水解，中性或弱碱性溶液中较在酸性溶液中，核酸易水解，中性或弱碱性溶液中较稳定。稳定。 核酸的理化性质核酸的理化性质第12页/共43页第十二页，编辑于星期

12、五：十五点 二十四分。细胞破碎细胞破碎 抽提去蛋白质抽提去蛋白质 沉淀核酸沉淀核酸基本过程基本过程第13页/共43页第十三页，编辑于星期五：十五点 二十四分。 机械方法：机械方法： 超声波处理法、研磨法、匀浆法；超声波处理法、研磨法、匀浆法； 化学试剂法：化学试剂法：用用SDSSDS处理细胞；处理细胞； 酶解法：酶解法： 加入溶菌酶或蜗牛酶，破坏细胞壁。加入溶菌酶或蜗牛酶，破坏细胞壁。 细胞破碎细胞破碎 第14页/共43页第十四页，编辑于星期五：十五点 二十四分。uSDSSDS法法 SDSSDS是有效的阴离子去垢剂是有效的阴离子去垢剂, , 细胞中细胞中DNADNA与蛋白与蛋白质之间常借静电引

13、力或配位键结合质之间常借静电引力或配位键结合, SDS, SDS能够破坏这种能够破坏这种价键。价键。uCTABCTAB法法 CTABCTAB是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与脂膜，是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与脂膜，使细胞中的使细胞中的DNA-DNA-蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质变蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质变性，使性，使DNADNA与蛋白质分离。与蛋白质分离。DNADNA提取提取第15页/共43页第十五页，编辑于星期五：十五点 二十四分。u 蛋白质蛋白质 常用苯酚：氯仿：异戊醇（常用苯酚：氯仿：异戊醇（2525：2424：1 1）或）或氯仿：异戊醇（氯仿：异戊醇（2424：1 1

14、）抽提。）抽提。u RNA RNA 常选用常选用RNaseRNase消化消化 ，或是用，或是用LiClLiCl来消除大分子来消除大分子的的RNARNA。u 酚类物质酚类物质 提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩的提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩的材料。材料。u 多糖多糖 提取液中加提取液中加1 1PVPPVP。DNADNA纯化（去杂质）纯化（去杂质）第16页/共43页第十六页，编辑于星期五：十五点 二十四分。实验材料实验材料 三叶草叶片三叶草叶片试剂试剂 2 2CTABCTAB抽提液抽提液 TE TE 缓冲液缓冲液(pH=8.0) (pH=8.0) 氯仿：异戊醇氯仿：异戊醇(24:1)(24:1)

15、 四、材料与试剂四、材料与试剂第17页/共43页第十七页，编辑于星期五：十五点 二十四分。离心机离心机 水浴锅水浴锅研钵研钵 微量移液器微量移液器仪器用具仪器用具第18页/共43页第十八页，编辑于星期五：十五点 二十四分。 CTAB法流程图植物材料裂解液上层溶液液氮研磨抽提细胞裂解干燥溶解离心洗涤异丙醇沉淀DNA溶液第19页/共43页第十九页，编辑于星期五：十五点 二十四分。五、实验方法(1) 2%CTAB抽提缓冲液在65水浴中预热。(2)取少量叶片（约1.5 g）置于研钵中，用液氮磨至粉状；(3) 在液氮挥发将尽而植物组织尚未解冻时迅即加入2-3ml的2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动；(4)

16、 将磨碎液分倒入1.5 ml的灭菌离心管中，磨碎液的高度约占管的三分之二；(5) 置于65的水浴槽或恒温箱中，每隔10 min轻轻摇动，20 min后取出；1. DNA的提取 第20页/共43页第二十页，编辑于星期五：十五点 二十四分。（6）冷却2 min后，加入氯仿-异戊醇（24：1）至满管，剧烈振荡23 min，使两者混合均匀；（7）放入离心机中10 000 rpm离心10 min，与此同时，将600 l的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中；（8） 用移液器轻轻地吸取上清夜，转入含有异丙醇的离心管内，将离心管慢慢上下摇动30 sec，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物；第21页/共43

17、页第二十一页，编辑于星期五：十五点 二十四分。（9）10000 rpm离心1 min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上；（10）60 sec后，直立离心管，加入750 l的75%乙醇放置20 min；（12） 10000 rpm离心1 min后，倒掉液体，再加入800 l 75%的乙醇，将DNA再洗 30 min；第22页/共43页第二十二页，编辑于星期五：十五点 二十四分。（13）10000 rpm离心30 sec后，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；数分钟后，直立离心管，干燥DNA（自然风干或用风筒吹干）；（14）加入50 l 0.5 TE(含

18、RNase)缓冲液，使DNA溶解，置于37恒温箱约15 h，使RNA消解；（15）置于-20保存、备用。第23页/共43页第二十三页，编辑于星期五：十五点 二十四分。1取取 1.5g 清洗凉干的新鲜叶片于研钵中，加清洗凉干的新鲜叶片于研钵中，加 1/3 药匙石英砂和药匙石英砂和 4mL 2 倍的倍的 CTAB 提取液，迅速研磨。提取液，迅速研磨。2将将 1mL 研磨液转入研磨液转入 1.5mL 离心管中，置于离心管中，置于65水浴中保温水浴中保温 20min，其间颠倒混匀其间颠倒混匀23次。次。破碎细胞破碎细胞3. 10000r/min 离心离心 5min，取上清液，取上清液700L转到另一离

19、心管中。加入等转到另一离心管中。加入等体积氯仿：异戊醇（体积氯仿：异戊醇（24:1）混合液，充分颠倒混匀。）混合液，充分颠倒混匀。10000r/min，离心离心 5min。抽提去蛋白抽提去蛋白4将上清液移入新的将上清液移入新的1.5mL离心管内，加离心管内，加 600L异丙醇。颠倒混匀，放置异丙醇。颠倒混匀，放置20min，可见可见 DNA 絮状沉淀。絮状沉淀。沉淀核酸沉淀核酸51,0000r/min，离心，离心 1min，倒掉上清液，将离心管倒置干燥。，倒掉上清液，将离心管倒置干燥。 将沉将沉淀回溶于淀回溶于20L TE 缓冲液待测。缓冲液待测。操作步骤操作步骤第24页/共43页第二十四页，

20、编辑于星期五：十五点 二十四分。1) 选取新鲜材料，研磨迅速彻底，研磨好的材料应与选取新鲜材料，研磨迅速彻底，研磨好的材料应与 CTAB 抽提液充分混匀；抽提液充分混匀；2) 若提取产物有颜色，可能是材料中含有较多的多酚类物质，添若提取产物有颜色，可能是材料中含有较多的多酚类物质，添加巯基乙醇（加巯基乙醇（25），尽可能选取幼嫩的材料；），尽可能选取幼嫩的材料；3）收集）收集 CTAB 与核酸形成的复合物时不要离心过度，否则沉淀与核酸形成的复合物时不要离心过度，否则沉淀再溶解难；再溶解难；4）为了获得具有生物活性的天然核酸，在分离制备过程中必）为了获得具有生物活性的天然核酸，在分离制备过程中必

21、须采用温和的条件，避免过酸过碱、剧烈地搅拌，防止热变须采用温和的条件，避免过酸过碱、剧烈地搅拌，防止热变性，同时还要避免核酸降解酶类的降解。性，同时还要避免核酸降解酶类的降解。5）由于植物细胞中含有大量的）由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使酶，使DNA降解。降解。注意事项注意事项第25页/共43页第二十五页，编辑于星期五：十五点 二十四分。 植物基因组DNA的提取 琼脂糖凝胶电泳检测第26

22、页/共43页第二十六页，编辑于星期五：十五点 二十四分。 DNA DNA分子在高于等分子在高于等电点的电点的PHPH溶液中带负溶液中带负电荷，在电场中向电荷，在电场中向正极移动。在一定正极移动。在一定电场强度下，电场强度下，DNADNA分分子的迁移速度与相对子的迁移速度与相对分子质量的对数成反分子质量的对数成反比。比。电泳原理电泳原理第27页/共43页第二十七页，编辑于星期五：十五点 二十四分。 琼脂糖是一种线性多糖聚合物。琼脂糖是一种线性多糖聚合物。 浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。第28页/共43页第二十八页，编辑于星期五：十五点 二十四分。仪器

23、和试剂仪器和试剂仪器仪器 电泳仪 电泳槽 灌胶模具等第29页/共43页第二十九页，编辑于星期五：十五点 二十四分。Tris-硼酸（TBE） Tris-乙酸（TAE） Tris-磷酸（TPE）常用电泳缓冲液常用电泳缓冲液 第30页/共43页第三十页，编辑于星期五：十五点 二十四分。电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400400组成上样缓冲液。组成上样缓冲液。 作用：作用：增加样品比重，以确保增加样品比重，以确保DNADNA均匀沉入加样孔内。均匀沉入加样孔内。形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。形

24、成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。使样品呈色，使加样操作更方便。使样品呈色，使加样操作更方便。上样缓冲液上样缓冲液第31页/共43页第三十一页，编辑于星期五：十五点 二十四分。溴化乙锭（溴化乙锭（EBEB）是一种荧光染料，是一种荧光染料，EBEB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫在紫外线激发下，发出红色荧光。外线激发下，发出红色荧光。其荧光强度与其荧光强度与DNADNA的含量成正的含量成正比。据此可粗略估计样品比。据此可粗略估计样品DNADNA浓度。浓度。 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶EBEB染色，肉眼可见核酸电泳带，其染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNAD

25、NA量一般量一般5ng5ng。核酸染色剂核酸染色剂注意事项：注意事项：EBEB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。第32页/共43页第三十二页，编辑于星期五：十五点 二十四分。DNADNA分子量标准分子量标准第33页/共43页第三十三页，编辑于星期五：十五点 二十四分。不同种类DNA Marker第34页/共43页第三十四页，编辑于星期五：十五点 二十四分。1.1.凝胶制备凝胶制备 制备制备0.8%0.8%琼脂糖凝胶。称取适量琼脂糖加入琼脂糖凝胶。称取适量琼脂糖加入 20mL 0.520mL 0.5TBETBE，加热至琼脂糖全部熔化，冷却至，加热至琼脂糖全部熔化，冷却至50-60 50-60 时，加入时，加入 EB EB 至终浓度至终浓度 0.50.5g/mLg/mL。缓慢倒入胶板，待胶凝。缓慢倒入胶板，待胶凝固后拔出梳子。固后拔出梳子。2.2.加样加样 取取1010lDNAlDNA样液与样液与 2 2l l上样上样 buffeer