DNA提取方法（沐风学堂）

1、环境环境DNA的提取方法的提取方法1听风学堂研究方法本实验室方法总结汇报提纲2听风学堂腐殖酸等去除破 壁预处理3听风学堂腐殖酸CTABPVPPPBS4听风学堂表面活性剂强离子剂 玻璃珠法超声波法冻融法低渗裂解、微波裂解颗粒破碎等 溶菌酶蛋白酶蜗牛酶化学试剂法化学试剂法酶解法酶解法物理法物理法细胞破碎5听风学堂SDS 的高盐提取法Edgcomb 改进法Tsai 报道的方法玻璃粉吸附法方法6听风学堂Your text in here1g土壤，研碎2.7 ml DNA提取液，20l蛋白酶k0.3ml 20% SDS 65水浴2h12000 r/min离心10min，取沉淀0.9ml DNA提取液0.

2、1ml 20% SDS，涡旋 10s， 65水浴10min收集上清，重复两次，合并上清，等体积苯酚:氯仿:异戊醇25:24:137225r/min振荡30 min1520min颠倒几下6000r/min10min离心乙醇沉淀12000r/min10min，100l无菌水溶解SDS高盐提取法7听风学堂1g土壤，研碎2mlPBS 37摇床225r/min振荡30min12000r/min离心10min1.5ml溶液I， 0.5ml溶菌酶， 37水浴2h，2ml溶液II， -20冰浴， 65水浴循环三次6000r/min离心10min，取上清，等体积苯酚:氯仿:异戊醇25:24:1抽提两次12000

3、r/min离心10min，100l无菌水溶解Tsai报道方法8听风学堂1g土壤，研碎加5mol/LNaCL 270l溶于0.7mol/LNaCL的5mol/L CTAB270l乙醇沉淀， 12000r/min离心10min， 100l无菌水溶解2mlPBS取上清液等体积苯酚:氯仿:异戊醇25:24:1，抽提两次2ml溶液II， 65水浴10min，将样品轻轻移至-20冰浴，65水浴三次1.5ml溶液， 0.5ml溶菌酶，37水浴1.5h12000r/min离心10min取沉淀6000r/min离10minEdgcomb改进法9听风学堂1g Sephadex G-200水化合用含高盐的TE缓冲液

4、洗5次,自然分离用1ml无菌注射器紧贴洗涤器底部将悬浮液抽出注入15ml的无菌螺帽塑料管中，不断离心(130g,10min)使颗粒塞紧管底直到形成1.1ml的压实柱100l含高盐的TE缓冲液冲洗，离心(130g,10min )转移至新的无菌螺帽塑料管中加入用玻璃粉匀化后的粗提取液100l，用100l含高盐的TE缓冲液洗涤并离心(130g,10min）连续3次，丁醇分离出DNA玻璃粉吸附法10听风学堂方法比较11听风学堂方法比较12听风学堂n采用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒对粗提的DNA样品进行纯化；n将待纯化的粗提DNA溶液用50TAE调整到1TAE；n加入两倍体积的溶液I，70温浴，

5、加入纯化柱内，离心，0.5ml 75%酒精清洗两次，加入双蒸水离心，取上清液；n透析袋电洗脱纯化回收法。（J萨姆布鲁克，E F弗里齐，T曼尼阿蒂斯 ）纯化纯化13听风学堂其他文献u杨建采用TENP和 PBS buffer对土样进行预处理 ；u熊开容等用冻融+玻璃珠+溶菌酶+SDS方法获得的DNA最适合于酶解和PCR扩增的要求；14听风学堂uTsai等采用EDTA和溶菌酶处理后再进行3次冻融处理，95%细胞被裂解；uJulia等采用试剂盒FastDNA Spin Kit for Soil ( BI0101，Vista，CA)获得了理想的土壤微生物多样性。 其它文献15听风学堂nKuske等用玻璃

6、珠研磨匀浆法裂解细胞，加入不同直径的玻璃株，直径为710-1180m玻璃珠珠可打碎土壤块和植物细胞，106 m玻璃珠可打碎细菌细胞；nKuske等用热裂解法、反复冻融法和玻璃珠研磨匀浆法从土壤中提取DNA的效果，发现热裂解法和玻璃珠研磨匀浆法联用效果较好。其它文献16听风学堂n氯化钙-SDS-酶法可以高效去除腐殖酸，所提取的 DNA 纯度较高；n可选择基于的高盐提取法和透析袋回收法。n杨建采用FastPrep法的DNA得率最高，但其成本较高；其它文献17听风学堂nEichner 调整法调整法 （Eicher C A, Erb R W, Timmis K N, et al. Appl Envir

7、on MicrobialJ. 1996，62(10): 3787-3793.)nKuske 修订法修订法 (Christense B, Fink J, Merrifield R B, et al. Proc Natl Acad Sci USAJ. 1998，85(14):5072-5076.)其它文献18听风学堂n用TENP和 PBS buffer或其他方法对土样预处理；n不同提取缓冲液对土壤DNA提取也有影响；n对提好的DNA进行真空抽干。总结总结19听风学堂n将土样分成几份，分别用不同的方法对土样进行预处理提DNA，并对其进行检测，如果结果不好，就把几种经处理的土样所提的DNA混合在一起，在进行下步实验。总结20听风学堂总结n重新纯化DNA；n重新沉淀DNA；n增加70乙醇洗涤的次数（2-3次）；n减少DNA降解；n尽量取新鲜材料，低温保存材料；n避免反复冻融；n细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔n所有试剂用无菌水配；n将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻