电镜观察样品时应注意几个问题

1、电镜观察样品时应注意电镜观察样品时应注意的几个问题的几个问题 一、对观察内容的初步鉴定一、对观察内容的初步鉴定 低放大倍数下（低放大倍数下（3000倍），根据细倍），根据细胞的形态和轮廓、细胞内和细胞间物质胞的形态和轮廓、细胞内和细胞间物质的伸延情况基本上可对组织类型做出初的伸延情况基本上可对组织类型做出初步判断。步判断。 二、正确使用放大倍数二、正确使用放大倍数 一般对组织的观察，从低倍开始；一般对组织的观察，从低倍开始；观察病毒在观察病毒在2-3万倍以上，观察大分子结万倍以上，观察大分子结构要构要10万倍以上。万倍以上。 三、局部与整体三、局部与整体 通观全局，避免片面性。一个细胞的超通观

2、全局，避免片面性。一个细胞的超薄切片只是一个细胞的薄切片只是一个细胞的1/100-1/500。观察时观察时现场记录；典型的代表性结构需摄片；经常现场记录；典型的代表性结构需摄片；经常需设对照组；观察时需设对照组；观察时2-3人为宜，对重要发现人为宜，对重要发现要相互核实。要相互核实。 四、形态与功能四、形态与功能 例如，肾衰时，尿中钠离子增高，近曲例如，肾衰时，尿中钠离子增高，近曲小管上皮细胞变性。小管上皮细胞变性。 五、动与静的对立统一五、动与静的对立统一 肝细胞寿命肝细胞寿命-18个月个月 红细胞寿命红细胞寿命-120天，每人每天天，每人每天平均死亡一千几百亿红细胞平均死亡一千几百亿红细胞

3、 消化管内壁细胞寿命消化管内壁细胞寿命-几十小几十小时时 细胞发育早、中、晚期，机体发育细胞发育早、中、晚期，机体发育幼年、青年、壮年、老年幼年、青年、壮年、老年六、人工损伤及其识别六、人工损伤及其识别 1、标本制作中人工损伤标本制作中人工损伤 固定损伤固定损伤:延误固定时间，固定液延误固定时间，固定液 渗透压渗透压 包埋损伤包埋损伤 超薄切片损伤超薄切片损伤:刀痕，颤痕刀痕，颤痕 玷污玷污:铅污染铅污染 2、电子束轰击电子束轰击七、电镜技术及其它先进技术结合七、电镜技术及其它先进技术结合 1、与中医相结合与中医相结合 2、与免疫电镜、细胞化学、能谱与免疫电镜、细胞化学、能谱相结合相结合扫描探

4、针显微镜及其在扫描探针显微镜及其在生物医学中的作用生物医学中的作用扫描探针显微镜及其在扫描探针显微镜及其在生物医学中的应用生物医学中的应用 医学的每一步前进必然建立在科技发展的基医学的每一步前进必然建立在科技发展的基础上，如础上，如18581858年开始的光学显微镜观察使对疾病年开始的光学显微镜观察使对疾病的认识到达了细胞水平，的认识到达了细胞水平，19501950年出现的电子显微年出现的电子显微镜把对疾病的认识提高到了亚细胞水平。镜把对疾病的认识提高到了亚细胞水平。 当代医学的发展已经到达了分子生物学广泛当代医学的发展已经到达了分子生物学广泛应用的时代，人们迫切需要对分子水平的结构、应用的时

5、代，人们迫切需要对分子水平的结构、形态进行直接的观察，扫描探针显微镜形态进行直接的观察，扫描探针显微镜（SPMSPM）的问世正是满足了这一要求。的问世正是满足了这一要求。 虽然电子显微镜的发明大大提高了成像分虽然电子显微镜的发明大大提高了成像分辨率，但苛刻的样品制备条件容易改变生物分辨率，但苛刻的样品制备条件容易改变生物分子的天然结构；另外，高真空状态的成像偏离子的天然结构；另外，高真空状态的成像偏离生物分子生理环境太远，使我们很难获得生物生物分子生理环境太远，使我们很难获得生物分子的真实结构信息和反应过程。应用分子的真实结构信息和反应过程。应用SPMSPM观观察物体可达到察物体可达到1010

6、8 8mm，并可直接对标本进行观，并可直接对标本进行观察，应用范围之广出乎人们的意料，其潜在的察，应用范围之广出乎人们的意料，其潜在的巨大作用正在被开发。巨大作用正在被开发。 SPMSPM主要类型有：扫描隧道显微镜主要类型有：扫描隧道显微镜（STMSTM）、原子力显微镜（）、原子力显微镜（AFMAFM）、扫描力显）、扫描力显微镜（微镜（SFMSFM）、扫描磁显微镜（）、扫描磁显微镜（SMMSMM）等，随）等，随着着SPMSPM领域的新技术的高速发展，还会有新的领域的新技术的高速发展，还会有新的型号出现，但其基本原理是建立在量子力学和型号出现，但其基本原理是建立在量子力学和压电材料技术上的。压电

7、材料技术上的。扫描隧道显微镜扫描隧道显微镜 扫描隧道显微镜扫描隧道显微镜（STMSTM）是根据量子是根据量子力学的电子隧道效应设计的。力学的电子隧道效应设计的。 当针尖（探针）与样品表面距离小当针尖（探针）与样品表面距离小于于1nm1nm以下时，针尖电子云与样品表面电以下时，针尖电子云与样品表面电子云重叠子云重叠-加上微小电压加上微小电压（2mV-2V2mV-2V）-针尖和样品间产生隧道电流针尖和样品间产生隧道电流样 品+ + +V(2mV-2V)+L1nm 针尖到样品表面原子的距离与隧道针尖到样品表面原子的距离与隧道电流成指数关系，所以间距的变化对隧电流成指数关系，所以间距的变化对隧道电流的

8、反应是十分敏感的。当针尖在道电流的反应是十分敏感的。当针尖在样品表面扫描时，间距则随样品表面起样品表面扫描时，间距则随样品表面起伏不平的形貌而变化着，因而隧道电流伏不平的形貌而变化着，因而隧道电流也随之变化着。记录变化的隧道电流，也随之变化着。记录变化的隧道电流，则可获得样品表面的形貌特征，达到观则可获得样品表面的形貌特征，达到观察样品表面原子结构图像的目的。但是察样品表面原子结构图像的目的。但是它要求被观察的样品必须具有导电性，它要求被观察的样品必须具有导电性，因此对生物样品的观察就受到限制。因此对生物样品的观察就受到限制。原子力显微镜原子力显微镜 原子力显微镜（原子力显微镜（AFMAFM）

9、的发明是建立在扫）的发明是建立在扫描隧道显微镜的基础上的，利用对微弱力极其敏描隧道显微镜的基础上的，利用对微弱力极其敏感、顶端带针尖的微悬臂对样品表面进行逐行扫感、顶端带针尖的微悬臂对样品表面进行逐行扫描，针尖最外层原子与样品表面原子之间的相互描，针尖最外层原子与样品表面原子之间的相互作用力使微悬臂发生形变或者改变运动状态，通作用力使微悬臂发生形变或者改变运动状态，通过检测微悬臂的偏转获得样品形貌和作用力等相过检测微悬臂的偏转获得样品形貌和作用力等相关信息供计算机成像。因此，关信息供计算机成像。因此，AFMAFM不要求样品不要求样品具有导电性，待测样品不需要特殊处理就可以直具有导电性，待测样品

10、不需要特殊处理就可以直接进行纳米尺度的观测。接进行纳米尺度的观测。AFMAFM在液态环境中也在液态环境中也可成像，而且针尖对样品表面的接触作用力较小，可成像，而且针尖对样品表面的接触作用力较小，能避免对样品造成大的损伤，所以能避免对样品造成大的损伤，所以AFMAFM成为对成为对自然状态下的细胞、生物大分子等进行纳米尺度自然状态下的细胞、生物大分子等进行纳米尺度实时观测的有效工具。实时观测的有效工具。生物样品标本制备生物样品标本制备 一般生物标本在常压、液态环境中可直接一般生物标本在常压、液态环境中可直接观察。观察。 培养细胞：取培养在玻片上的细胞，用培养细胞：取培养在玻片上的细胞，用PH7.4

11、PH7.4的的PBSPBS缓冲液洗，缓冲液洗，1.5%1.5%戊二醛固定戊二醛固定5 5分钟，分钟，蒸馏水冲洗蒸馏水冲洗3 3次，干燥，次，干燥，AFMAFM观察。观察。 生物样品超薄切片法：标本在冰冻的生物样品超薄切片法：标本在冰冻的2%2%戊戊二醛固定后，经过二醛固定后，经过0.1mol/l PBS0.1mol/l PBS缓冲液冲洗，乙缓冲液冲洗，乙醇梯度脱水，环氧丙烷中过夜，环氧树脂包埋，醇梯度脱水，环氧丙烷中过夜，环氧树脂包埋，半薄切片定位，超薄切片捞在新解离的云母上，半薄切片定位，超薄切片捞在新解离的云母上，干燥后用干燥后用AFMAFM在空气中进行观察。在空气中进行观察。应应 用用

12、AFMAFM对细胞膜表面研究分为：第一阶对细胞膜表面研究分为：第一阶段是对大量的细胞膜表面（包括细胞内、段是对大量的细胞膜表面（包括细胞内、外表面）外貌、粘度、硬度、弹性、力学外表面）外貌、粘度、硬度、弹性、力学等信息的观测。第二阶段是对膜表面的标等信息的观测。第二阶段是对膜表面的标记物（如抗体）和作用物（如药物和甾体记物（如抗体）和作用物（如药物和甾体物质）的观察。第三阶段对信息传导、细物质）的观察。第三阶段对信息传导、细胞连接、细胞膜表面生化反应等的研究。胞连接、细胞膜表面生化反应等的研究。目前研究主要处于前两个阶段。目前研究主要处于前两个阶段。 AFMAFM在核酸及其蛋白质复合物结构在核

13、酸及其蛋白质复合物结构研究中的应用已日趋广泛。为了提高研究中的应用已日趋广泛。为了提高AFMAFM成像分辨率、保证所获得结果的可靠性和成像分辨率、保证所获得结果的可靠性和再现性，必须重视再现性，必须重视DNADNA样品的制备过程。样品的制备过程。成像成像DNADNA分子时，选择合适的针尖、合分子时，选择合适的针尖、合适的成像方式、合适的成像环境，减小针适的成像方式、合适的成像环境，减小针尖和尖和DNADNA分子间的力作用，都有利于提分子间的力作用，都有利于提高成像质量。高成像质量。评评 价价 AFM AFM的被测样品无需进行复杂的处理，对的被测样品无需进行复杂的处理，对成像环境也没有什么特别要

14、求，保证了所观察的成像环境也没有什么特别要求，保证了所观察的样品表面结构的真实性。由于样品表面结构的真实性。由于AFMAFM针尖采集的表针尖采集的表面结构图可在扫描过程中以三维形式直接显示到面结构图可在扫描过程中以三维形式直接显示到计算机屏幕上，因此可以定量分析被检测样品的计算机屏幕上，因此可以定量分析被检测样品的空间构像，这一特点是目前已有的其他显微技术空间构像，这一特点是目前已有的其他显微技术无法比拟的。无法比拟的。 虽然虽然SPMSPM问世才短短问世才短短1010年，但其在生物医学年，但其在生物医学上应用的巨大潜力已经明示在我们面前，上应用的巨大潜力已经明示在我们面前，SPMSPM的的广

15、泛应用使我们进入到疾病的原子水平的认识上，广泛应用使我们进入到疾病的原子水平的认识上，提高医学基础科研水平，为临床发展提供动力和提高医学基础科研水平，为临床发展提供动力和线索。线索。电子显微学在结构生物学电子显微学在结构生物学研究中的新进展研究中的新进展电子显微学在结构生物学电子显微学在结构生物学研究中的新进展研究中的新进展 电子显微学是结构生物学的重要分支，已电子显微学是结构生物学的重要分支，已经成为一种公认的研究生物大分子、超分子复经成为一种公认的研究生物大分子、超分子复合体及亚细胞结构的有力手段。合体及亚细胞结构的有力手段。 半个多世纪以来电子显微学的奋斗目标主半个多世纪以来电子显微学的

16、奋斗目标主要是力求观察更微小的物体结构、更细小的实要是力求观察更微小的物体结构、更细小的实体、甚至单个原子，并获得有关试样的更多的体、甚至单个原子，并获得有关试样的更多的信息，以便对材料、生物样品的显微结构进行信息，以便对材料、生物样品的显微结构进行综合分析。综合分析。透射电子显微镜透射电子显微镜 高分辨电子显微学高分辨电子显微学（ HREM ）及原子像的观察及原子像的观察 像差校正电子显微镜像差校正电子显微镜 原子尺度电子全息学原子尺度电子全息学 表面的高分辨电子显微正面成像表面的高分辨电子显微正面成像 超高压电子显微镜超高压电子显微镜 中等电压中等电压（200kV,300kV）电子显微镜电

17、子显微镜 分析电子显微镜分析电子显微镜（120kV,100kV） 场发射枪扫描透射电子显微镜场发射枪扫描透射电子显微镜 能量选择电子显微镜能量选择电子显微镜 美国美国GATAN公司的电子能量选择成公司的电子能量选择成像系统装在投影镜后方，可对电子能量像系统装在投影镜后方，可对电子能量损失谱选择成像。可在几秒钟内实现在损失谱选择成像。可在几秒钟内实现在线的数据读出、处理、输出、及时了解线的数据读出、处理、输出、及时了解图像的质量，据此自动调节有关参数，图像的质量，据此自动调节有关参数，完成自动合轴、自动校正像散和自动聚完成自动合轴、自动校正像散和自动聚焦等工作。焦等工作。 透射电镜经过了半个多世

18、纪的发展已接近透射电镜经过了半个多世纪的发展已接近或达到了由透镜球差和衍射差所决定的或达到了由透镜球差和衍射差所决定的0.10.2nm的理论分辨本领。人们正在探索进一步的理论分辨本领。人们正在探索进一步消除透镜的各种像差，研究新的像差校正法，消除透镜的各种像差，研究新的像差校正法，进一步提高电磁透镜和整个仪器的稳定性；采进一步提高电磁透镜和整个仪器的稳定性；采用并进一步发展高亮度电子源场发射电子枪，用并进一步发展高亮度电子源场发射电子枪，X射线谱仪和电子能量选择成像谱仪，慢扫描射线谱仪和电子能量选择成像谱仪，慢扫描电荷耦合器件电荷耦合器件CCD，冷冻低温和环境试样室，冷冻低温和环境试样室，纳米量级的会聚束微衍射，原位实时分析，全纳米量级的会聚束微衍射，原位实时分析，全数字控制，图像处理与现代信息传送技术实现数字控制，图像处理与现代信息传送技术实现远距离操作观察，以及克服试样本身带来的各远距离操作观察，以及克服试样本身带来的各种限制，透射电镜正面临着一个新的重大突破。种限制，透射电镜正面临着一个新的重大突破。扫描电子显微镜扫描电子显微镜 分析扫描电镜和分析扫描电镜和X X射线能谱仪射线能谱仪（EDS） 、X X射线射线波谱仪波谱仪（WD