单核苷酸突变

1、克莱德飞 基因敲除动物模型一直以来是在活体动物上开展基因功能研究、寻找合适药物作用靶标的重要工具。但是传统的基因敲除方法需要通过复杂的打靶载体构建、ES细胞筛选、嵌合体小鼠选育等一系列步骤，不仅流程繁琐、对技术的要求很高，而且费用大，耗时较长，成功率受到多方面因素的限制。 CRISPR/Cas9该技术与以往的技术不同，是利用靶点特异性的 RNA 将 Cas9 核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割导致突变。通过一系列研究，该方法构建的基因突变动物具有显著高于传统方法的生殖系转移能力，是一种可靠、高效、快速的构建敲除动物模型的新方法。 CRISPR/Cas9 是细菌和古细菌免疫

2、防御系统，该系统通过将DNA 的片段整合到 CRISPR 中，并利用相应的 CRISPR RNAs（crRNAs）来指导同源序列在Cas9 核酸酶作用下降解，从而提供免疫性。 能够对大片段的基因组 DNA 进行删除，也可以在同一只小鼠中，同时使不同基因产生多个基因突变。 将Cas9/sgRNA 与带突变的序列共注射，能准确在小鼠基因引入所要的位点突变。 SNMs(单核苷酸突变)与多种人类疾病相关。预期CRISPR/Cas9基因编辑系统将是诱导小鼠单核苷酸突变的理想方法。本设计探究用CRISPR/Cas9载体和单链DNA共转入受精卵的雄原核制备白化病小鼠的可行性。 首先为酪氨酸酶基因构建一个CR

3、ISPR/Cas9表达载体px330-Tyr-M。该载体的活性通过EGxxFP系统进行验证。我们还设计了一个ssDNA(单链DNA)序列对目标基因进行同源重组定向修饰。 CRISPR/Cas9质粒与ssDNA供体共同转染C57BL/6J小鼠受精卵的雄原核。共操作了224个单细胞时期的受精卵，得到60只小鼠，其中眼、皮肤白化病(除眼色素缺乏和视力低下、畏光等症状外，小鼠皮肤和毛均有明显色素缺乏）的小鼠28只，测序分析发现其中11只小鼠在络氨酸酶基因(G291T)上发生了单核苷酸突变，其中有一只为纯合子突变。没有发生络氨酸酶基因(G291T)单核苷酸突变的小鼠，在其靶位点附近也发生了基因缺失和插入

4、的突变。 利用CRISPR/Cas9载体和ssDNA供体共同转染受精卵的雄原核制备研究人类疾病的动物模型是可行的。 CRISPR/Cas9表达载体的构建：px330-Tyr-M px330-Tyr-M 载体活性验证 px330-Tyr-M载体与变异的ssDNA供体共转入小鼠受精卵 白化病小鼠基因测序 脱靶验证 传代稳定性验证 px330质粒被用来表达靶位点的gRNA（向导RNA）和Cas9 核酸蛋白。 我们将络氨酸酶基因的279298 bp的序列插入px330质粒，最后得到 px330-Tyr-M载体。 CRISPR/Cas9系统可识别并切开G-N(20)-GG序列，我们挑选络氨酸酶基因的279301位点。 测序了与目的基因相似的几个基因（3端的16个基因NGG）没有发生脱靶。 科学家们利用RNA引导Cas9核酸酶可在多种细胞（包括iPS）的特定的基因组位点上进行切割，修饰。与ZFN/TALEN相比，CRISPR/Cas更易于操作，效率更高，更容易得到纯合子突变体，而且可以在不同的位点同时引入多个突变。但该系统是否有脱靶效应尚需进一步的研究。 传统的转基因和基因打靶技术，由于技术稳定成熟，可以对小鼠和大鼠的基因组序列进行各种修饰，仍将是模式动物的构建的主要技术。 核酸酶ZFN/TALEN 尤其是C