氨甲酰磷酸合成酶单克隆抗体的制备、鉴定及应用

1、氨甲酰磷酸合成酶单克隆抗体的制备、鉴定及应用【摘要】目的：制备抗人氨甲酰磷酸合成酶(cpsi)的单克隆抗体(mab)并进行初步鉴定与应用。方法:将正常成人肝组织匀浆离心并 分离线粒体,用线粒体总蛋白免疫balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备 mab,并通过间接elisa法.westernblot.免疫组化及免疫荧光染色的 方法对mab进行特性鉴定，通过免疫沉淀联合质谱、uni zapxr表达 文库筛选鉴定抗原，借助免疫捕获的方法用抗体來分离复合物。结果:获得3株可稳定分泌抗人cpsimab的朵交瘤细胞系。mab的ig亚类(型) 为iggl (k)，该mab可用于elisa检测、westernbl

2、ot、免疫组化、 免疫荧光染色、免疫沉淀实验和复合物的分离。结论:成功制备了抗人cpst的mab,为cpst的研究提供了有力的工具。【关键词】氨甲酰磷酸合成酶(cpsi)单克隆抗体特性氨 甲 酰 磷 酸 合 成 酶 (humancarbamy 1 phosphatesynthetasel, cpst/ec6. 3. 4. 16)是肝脏细 胞能量代谢中尿素循环中的关键酶，而尿素循环的代谢途径为肝脏细 胞线粒体的一项主耍功能,氨甲酰磷酸合成酶可以去除细胞中多余的 氨，此酶缺失可以导致高氨血症。我们在成人肝脏线粒体单克隆抗体 (mab)库的建立屮，应用线粒体总蛋白免疫balb/c小鼠制备mab,获得

3、3 株鼠抗人cpsimab,并对其特异性进行了鉴定。这为进一步研究cps1在代谢中的作用提供参考。1材料和方法11材料免疫和筛选用成人肝组织线粒体总蛋白，由本室制备;弗氏佐剂购 口 sigma公司；羊抗鼠igg hrp购口中ill公司；蛋白酶抑制剂购口 roche 公司:hitraptmproteinghp 抗体纯化柱购自 amersham 公司;bca 蛋白定量试剂盒购自pierce公司:pvdf膜购自amersham公司:ecl反 应试剂盒购自amersham公司；半干转印仪购自biorad公司；dy89ii型电动玻璃匀浆机购自宁波新芝生物科技股份有限公司。12方法1. 2.1成人肝组织线

4、粒体总蛋口抗原的制备成人肝组织匀浆700750r/min, 10g组织加40ml匀浆缓冲液 800g离心lomin,取上清,10000g离心lomin,沉淀即为线粒体,用匀浆 缓冲液洗2次。用rtpa裂解液裂解线粒体样品，离心后取上清,获得线 粒体总蛋白。采用bca法测定蛋白浓度，计算线粒体的得率，通过测定 匀浆液和分离的线粒体中的琥珀酸脱氢酶的活性计算线粒体的富集 度,sds page鉴定抗原的相对分了质量(mr)。1.2.2鼠抗人mab的制备将线粒体总蛋白lmg与等体积弗氏完全佐剂混合后进行充分乳化, 多点皮下注射。首次免疫后4周加强免疫1次，1周后经尾静脉取血， 分离血清,elisa法测

5、定效价。融合前3d进行加强免疫，取小鼠脾细胞 与x 653细胞进行细胞融合,采用杂交瘤技术制备mab1.2.3抗原的鉴定(1)抗原的质谱鉴定:应用mab从线粒体总蛋白中免疫沉淀抗原, 并进行sds page电泳，根据westernblot结果显示的阳性条带，从sdspage胶上切下相应的条带，酶切，质谱鉴定。抗原的unizapxr表达文库筛选鉴定:取大肠杆菌xl1bluemrf'过夜培养菌接种于lb培养液中，37°c震荡培养至a600为0. 7左 右,3000r/min下离心lomin,用10mmol/l的硫酸镁重悬细菌沉淀至 a600为0. 5,取适当稀释的文库6011l

6、(含约50000个噬菌体)与600 u l 重悬的xl1 bluemrf'混匀后37°c温育20min,铺至150im的nzy lb平板上,42°c倒置培养至噬菌斑模糊可见，将浸泡过iptg的nc膜覆 盖表面,37°c继续培养3. 5h,用防水墨水定位后，剥离滤膜，进行常规dotblot检测。在原位板上回收阳性克隆，用exassist辅助噬菌体进 行体内剪切、测序及westernblot分析。1. 2. 4mab的鉴定(1)westernblot分析:线粒体总蛋口经sds page后，电转至 pvdf膜上。用50g/l脱脂奶粉室温下封闭lh,然后加入1 ：

7、2000稀释的mab,室温下孵育2h, tbst缓冲液洗膜后，加入羊抗鼠 igg hrp抗体(1 : 5000稀释)，室温下孵育lh, tbst缓冲液洗膜 后,ecl法显色。(2)免疫组化鉴定:用丙酮固定的冰冻成人肝组织切 片,pbst浸洗3min后每个组织片滴加25mg/l的avidin50 n l,室温孵 育15min,滴加h202 甲醇，室温孵育15mino滴加正常羊血清室温下 封闭20min,加入1 : 100稀释的鼠抗人cpslmab, 4°c孵育过夜。pbs洗 片后加入羊抗鼠igg hrp, 37°c孵育30min, pbs洗片后进行dab显色, 苏木素复染，返

8、蓝后封片。(3)免疫荧光染色：取 1 ivercarcinomacelis (iicv)细胞，用2. 5g/l胰蛋白酶消化，制成单细 胞悬液，将细胞接种到预先放置盖玻片的培养皿中，置 50ml/lc02, 37°c孵箱中培养13d,待细胞接近长成单层，加入适当稀 释的罗丹明123,置50ml/lc02, 37°c孵箱屮培养30min,取出盖玻片，浸 apbs (0. 01mol/l, ph7.4),洗2次。40g/l多聚甲醛(lg/ltween20)固定5min。将已固定的 细胞玻片用pbs振洗5min,取出吹干。加羊血清封闭37°c,30min。滴 加适当稀释的

9、特异抗体(线粒体蛋白mab),置湿盒内，37°c保温30min。 tbst振洗3次。滴加适当稀释的荧光素抗体(罗丹明标记山羊抗小鼠 igg ) ( rhodamine ( tritc ) conjugatedaffinipuregoatanti mouseigg(h+l),37°c保温30mino tbst振洗3次，蒸憾水振洗1次。50讥几缓冲甘油封片，荧光显微镜观察,拍照。1.2. 5mab的应用抗体用于复合物的分离,取成人肝脏组织线粒体加入20g/ln dodecyl b i) mal tosi de,冰浴 30min, 180000g离 心 30min, 取 上 清

10、a将25mmol/ldimethylpimelimimidate, beh045mab, proteing, 混 合 30mino3000r/min,离心lmin,弃上清，加入0. 2mol/l乙醇胺，混合3h。 3000r/min,离心lmin,弃上清，加入iml磷酸盐缓冲液重悬沉淀，加入 上清a, 4°c混合过夜。3000r/min,离心lmin,弃上清，沉淀用磷酸盐缓 冲液加入 0. 5g/ln dodecyl b d maltoside 洗 6 次。用 2 倍 柱体积的0. lmol/l甘氨酸洗2次，离心后取上清。上清用mr为3500 超滤管超滤浓缩，用于一维、二维电泳。2结

11、果2.1成人肝组织线粒体总蛋白抗原的制备通过差速离心方法分离线粒体，每克肝组织可得到810mg线粒 体蛋白。通过测定琥珀酸脱氢酶活性并计算线粒体富集度，多次结果显 示为线粒体富集度为47倍。成人肝组织线粒体总蛋白经sds page, 显示其mr丄要分布在2500075000之间，与文献报导一致1 ,可作 为免疫动物的抗原。2. 2鼠抗人mab的制备及初步鉴定应用细胞融合、筛选和克隆化，共获得23株抗人肝脏线粒体阳性 的细胞株。其中1株beh045经elisa检测效价约为1 ： 128000,其亚 类（型）为 iggl （k ）o2. 3抗原特异性鉴定（1）抗原的质谱鉴定：ip和westernb

12、lot结果显示。在23株杂交 瘤细胞中,beh045可特异识别成人肝组织中mr约为160000的蛋白（图 l）o应用beh045mab从线粒体总蛋白中免疫沉淀相应的抗原,并进行 sds page电泳，从sds page胶上切下mr约为160000的蛋白，质 谱鉴定结果为氨甲酰磷酸合成酶。（2）抗原的uni zapxr表达文库筛 选鉴定:用获得的beii045的细胞培养上清对肝脏cdna表达文库进行筛 选，以50000个克隆的密度铺板，筛选阳性克隆,分离独立的阳性克隆 进行体内剪切和测序。测序结果表明,beh045识别的蛋口为cpsi,mr 为160000,与免疫沉淀结果一致。为了进一步证明筛选

13、的可靠性，又对 分离到的阳性克隆进行了 westernblot鉴定。结果显示，抗体beh045 与诱导后的细菌总蛋白有特异的反应条带，位于mr约为160000处，与 用pbluescriptsk载休构建cdna文库进行融合表达的蛋白mr 一致。 因此,beh045识别的蛋白为cps1 2o2. 4mab的免疫组化鉴定免疫组化结果显示，鼠抗人cpslmab所识别的分子位于肝细胞的 胞质（图2）。2. 5mab的亚细胞定位免疫荧光染色结果显示，鼠抗人cpslmab所识别的分子位于肝细 胞的线粒体（图3）。2. 5mab分离复合物借助免疫沉淀的方法，应用beh045mab分离相应抗原及抗原相关 蛋白

14、质，从电泳图中可以看出有多条蛋口质条带（图4）,而 westernblot结果显示beh045mab识别的蛋白质mr在160000左右，那 么未被beh045mab识别的蛋口质有可能是beh045mab识别的蛋口质cps1复合物的组成部分或相关蛋白质。将beh045mab捕获的蛋白质进 行双相电泳，胶上蛋白质酶切，质谱分析，结果鉴定出7种蛋白质( humancarbamylphosphatesynthetasei, 78000glucoseregulatedproteinprecursor, nonspecificlipid transferproteinmitochondrialprecur

15、sor, proteindisulfideisomer asea3precursor, argininosuccinatesynthase, stress70proteinmitochondrialptecursor, hypotheticalproteindkfzp686j 18235)o这些酶与葡萄糖代谢中的尿酸循环、tca循环、氨的代谢和脂类 代谢有关。3讨论本研究旨在分离人肝脏细胞线粒体，用总蛋白免疫小鼠，并进行了 3次细胞融合，共获得了 23株杂交瘤细胞株。所获得的抗体中有3株(mbeh045. maad309. mbfg021)是针对 cps1 的 mab。westernblot

16、结果显示抗休识别的蛋白mr在160000左右。cpsi市位于染色体2q35的cpsi基因编码。人cpsi基因有 > 120000的基因组dna,有38个外显子和37个内含子。cpsi的前 体( 165000)在胞质中合成，而后转运到线粒体裂解为成熟的酶 (160000) 3o cpsi活性的调节依赖于n 乙酰谷氨酸的水平。cps1 是尿酸循环的一个酶，特异地表达于肝脏的线粒体和小肠的内皮细胞4。cps1缺失可引起尿酸循环障碍导致高氨血症5。cpsi缺失 (cpsid)为常染色体隐性遗传，表现为婴儿期破坏性的代谢疾病或晚期 更严重的发作。氨甲酰磷酸合成酶的单克隆抗体有可能研制成为特

17、异 识别氨甲酰磷酸合成酶的试剂从而为临床诊断与治疗提供帮助。cpst在休内是以复合物的形式存在的。以往的研究结果表明cps1 与线粒体中天冬氨酸氨基转移酶能够形成复合物，但与尿酸循环中其 他酶的关系尚未充分阐明。因此对于将来更好地研究cps1复合物的结 构和功能，更充分地了解尿酸循环的分子机制,beh045mab是一个很好 的工具。抗体捕获组分的分析有助于蛋白质复合物及其相互作用的研 究,也在新的蛋白质发现和确认方面提供重要信息和证据。【参考文献】 1 moothav, bunkenborgj, olsenj, eta.1. integratedanalysisofproteinc ompos

18、ition, tissuediversity, andgeneregulationinmousemitochond ria j .cell, 2003, 115 (5) : 629-640.2 gaoj, gaoy, juy, eta 1. proteomicsbasedgenerationandcharacterizationofmonoclonalantibodiesagai nsthumanli venni tochondri alproteinsj proteomics, 2006, 6(2):427-437.3su miliar ml, hallld, eedsam, eta 1. charac t er izationof genomics true tu reandpolymorphi smsinthehumancarbamylphosphatesynthetasetgene j gene, 2003, 311:51-57.4funghinis, donatima, pasquinie, eta1. structuralorganizationofth ehumancarbamylphosphatesynthetaselgene(cps1)andi den