RNA基本操作技术

1、rna基本操作技术 真核生物的基因组dna非常庞大，而且含有大量的重复序列，无论用电泳分离技术还是用杂交方法度难以分离到靶基因片段。而cdna则来自反转录的mrna，不带有多余序列，通过特异性探针筛选cdna文库，可以较快的分离到相关基因。rna基本操作技术 1.总dna的提取 2.mrna的纯化 3.cdna的合成 4.cdna文库的构建 5.基因文库的筛选1.总rna的提取 1.1 rna的种类及特点 总rna包括mrna,rrna,trna以及一些小rna（srna）。一个典型的动物细胞中，80%-85%为rrna 、15%-20%为trna及srna，mrna约占总rna的1%-5%。

2、 rrna电泳后的三条特征性条28s、18s和5s是鉴定总rna纯度和完整性的重要参数。 mrna呈单链状，易受核酸酶的攻击，操作时必须保证实验环境、所用器皿及溶液均无rna酶的污染。1.2总rna的提取方法 1.2.1 trizol法 原理： trizol试剂使用最广泛的抽提rna的专用试剂，主要由苯酚苯酚和异硫氰酸瓜异硫氰酸瓜组成可以迅速破坏细胞结构，使存在于细胞质及核内的rna释放出来并使核糖体蛋白与rna分离，还能保证rna的完整性。1.2总rna的提取方法 提取步骤 1.用液氮研磨材料，匀浆加入trizol试剂，进一步破碎细胞并溶解细胞成分。 2.加入氯仿抽提，离心，分离水相和无机相

3、，收集含rna的水相。 3.用异丙醇沉淀，漂洗溶解。1.2总rna的提取方法 1.2.2普通离心柱法 原理: 含有目的rna的细胞破碎液通过该柱时，硅胶模对rna的吸附，使rna与其他成分分开，在低盐浓度下可从硅胶模上直接洗脱。1.2总rna的提取方法 1.2.3氧化锂法 基本原理：采用高浓度尿素变性蛋白，并抑制rna酶，用氯化锂选择沉淀rna。本法特别适用于从大量样品中提取少量组织rna，并具有快速简捷的长处，但也存在少量dna的污染及rna得率不高、小rna片段丢失的缺陷。1.2总rna的提取方法 提取步骤提取步骤 1.对大量组织或细胞，加入氧化锂-尿素溶液，匀浆器高速匀浆。 2.匀浆液在

4、0-4,静置，离心 3.取沉淀加入氧化锂-尿素溶液，重复步骤2 4.加入等体积酚：氯仿：异戊醇，室温静置，离心。 5.取上层水相，加乙酸钠-20静置，离心。 6.70%乙醇沉淀，真空干燥。 7.rna溶解液溶解沉淀，-70保存。1.2总rna的提取方法 1.2.4用n-p40法 基本原理：细胞置于低渗透压下，从外界环境吸水而膨胀，处于易裂解状态。利用表面活性剂乙基苯基聚乙二醇（ n-p40 ）使细胞膜的通透性增强，从而使细胞裂解。1.2总rna的提取方法 提取步骤 1.细胞（或组织粉末）中加裂解缓冲液（vrc），吹打，冰上静置。 2.加np-40，搅拌，离心，加蛋白酶缓k冲液。 3.离心，取上

5、清，加蛋白酶k缓冲液,混匀，37保温。 4.加酚，搅拌混匀，室温，离心，取上清。 5.加酚：氯仿：异戊醇搅拌，室温，离心，按3,4步再抽提一次。 6.取上清，加naac和异丙醇，-70 静置。 7.离心，弃上清，沉淀用80%乙醇漂洗，离心。 8.弃上清，干燥沉淀，溶解沉淀。1.2总rna的提取方法 1.2.3 植物组织中rna的提取方法1.3rna浓度和纯度的测定 1.31通过测定其od260和od280来判断。 od260为1时相当于浓度为4/ml。 如果od260/ od280在1.8-2.0，表示所提取的rna纯度较好。 如果od260/ od280明显低于1.8，表示样品中可能有蛋白质或酚污染。1.