动物生化实验实验牛乳中蛋白质的提取与鉴定

1、了解蛋白质的化学性质；了解蛋白质的化学性质；掌握蛋白质的提取方法和鉴定理。掌握蛋白质的提取方法和鉴定理。 牛乳中含丰富的蛋白质（水分牛乳中含丰富的蛋白质（水分87.8%87.8%、脂、脂肪肪3.5%3.5%、蛋白质、蛋白质3.1%3.1%、乳糖、乳糖4.9%4.9%、灰分、灰分0.7%0.7%、能量、能量29.kg/100kg29.kg/100kg），其中主要是），其中主要是酪蛋白。酪蛋白在牛乳中约占总蛋白量酪蛋白。酪蛋白在牛乳中约占总蛋白量的的5/65/6。 蛋白质是含羧基和氨基的两性电解质，在某蛋白质是含羧基和氨基的两性电解质，在某一一phph值溶液中，蛋白质分子所带的正电荷和值溶液中，蛋

2、白质分子所带的正电荷和负电荷相等，蛋白质以两性离子状态存在，负电荷相等，蛋白质以两性离子状态存在，这时溶液的这时溶液的phph值，称为该蛋白质的等电点值，称为该蛋白质的等电点（pipi）。）。 在等电点时，蛋白质所带净电荷为零，在等电点时，蛋白质所带净电荷为零，溶解度最小，蛋白质沉淀析出，利用蛋白质溶解度最小，蛋白质沉淀析出，利用蛋白质的这个特点可将蛋白质提取出来。的这个特点可将蛋白质提取出来。 由于粗提出的酪蛋白中还含有脂肪，可由于粗提出的酪蛋白中还含有脂肪，可用乙醇和乙醚洗涤除去。用乙醇和乙醚洗涤除去。酪蛋白酪蛋白中中含含有有酪酪氨酸残基，氨酸残基，酪酪氨酸残基的氨酸残基的r r基团为基团

3、为： 含含酚羟基，可与米伦试剂反应先生成白色絮状酚羟基，可与米伦试剂反应先生成白色絮状沉淀，继续反应生成红色沉淀。沉淀，继续反应生成红色沉淀。 蛋白中还含有含硫氨基酸（胱氨酸、半蛋白中还含有含硫氨基酸（胱氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸），在碱性溶液中水解胱氨酸和蛋氨酸），在碱性溶液中水解后可与醋酸铅反应生成黑色的铅盐后可与醋酸铅反应生成黑色的铅盐 三、操作步骤三、操作步骤（一）酪蛋白的制备（一）酪蛋白的制备新鲜牛奶、醋酸纳缓冲液各新鲜牛奶、醋酸纳缓冲液各5ml5ml 4040 分别加热至同样温度分别加热至同样温度 上清液：上清液：保留做鉴定（烧杯）（保留做鉴定（烧杯）（三）三）边加边摇混匀边加边摇混匀

4、 5min 5min 沉淀沉淀 加加4ml95%4ml95%的乙醇的乙醇 离心离心5 5分钟分钟 上清液：弃去上清液：弃去 沉淀：做鉴定沉淀：做鉴定3000r/min离心离心（二）酪蛋白的性质鉴定（二）酪蛋白的性质鉴定1 1、溶解度、溶解度 取取3 3支试管支试管+ 0.1m naoh+ 0.1m naoh、 0.2m 0.2m hclhcl、 10%nacl10%nacl各各2ml+2ml+少许酪蛋白少许酪蛋白振荡振荡观察溶解快慢。观察溶解快慢。2 2、米伦反应、米伦反应 1ml h2o 少许酪蛋白少许酪蛋白 观察观察 10滴米伦试剂。加热滴米伦试剂。加热（三）乳清中可凝固性蛋白质鉴定：（三

5、）乳清中可凝固性蛋白质鉴定： 将第一次离心所得的上清液徐徐加热，出现蛋白将第一次离心所得的上清液徐徐加热，出现蛋白质沉淀（球蛋白、清蛋白）。质沉淀（球蛋白、清蛋白）。 四、实验结果四、实验结果 五、讨论五、讨论二、常用生化仪器使用二、常用生化仪器使用 离心机离心机 离心技术离心技术（centrifugal techniquecentrifugal technique）：根据颗粒作匀速圆周）：根据颗粒作匀速圆周 运动时受到一个外向的离心力的行为而发展起来运动时受到一个外向的离心力的行为而发展起来 的一种分离技术。的一种分离技术。 离心技术应用很广，诸如分离出化学反应后的离心技术应用很广，诸如分离

6、出化学反应后的沉淀物沉淀物，天然的生物大分子、无机物、有机物，在生物化学以及其它天然的生物大分子、无机物、有机物，在生物化学以及其它的生物学领域常用来收集细胞、细胞器及生物大分子物质。的生物学领域常用来收集细胞、细胞器及生物大分子物质。离心机种类离心机种类按按用途用途： 有分析用、制备用及分析有分析用、制备用及分析- -制备分；制备分； 按按结构特点结构特点： 有管式、吊蓝式、转鼓式和碟式等；有管式、吊蓝式、转鼓式和碟式等； 按按转速转速： 有为常速（低速）、高速和超速三种。有为常速（低速）、高速和超速三种。实验室用普通低速离心机实验室用普通低速离心机实验室普通离心机使用方法实验室普通离心机使

7、用方法1.1.将离心机放在坚实而平整的工作台上；将离心机放在坚实而平整的工作台上；2.2.在适用的离心管中加入样品，在适用的离心管中加入样品，必须必须对称配重，否则会对称配重，否则会损坏离心机；损坏离心机；3.3.按离心机转头的离心管位置刻度所对应孔插入，放下按离心机转头的离心管位置刻度所对应孔插入，放下离心机顶盖；离心机顶盖；4.4.检查确认调速钮处于最低速位置；检查确认调速钮处于最低速位置；5.5.打开电源开关，调速到需要的转速；打开电源开关，调速到需要的转速；6.6.选择工作时间，调选择工作时间，调“选时选时”钮到需要的位置。钮到需要的位置。7.7.离心完成，离心机自然停止。离心完成，离心机自然停止。 2、离心机使用离心机使用注意事项注意事项 (1）严禁各种液体和杂物进入离心工作室，那）严禁各种液体和杂物进入离心工作室，那样会损坏主机；样会损坏主机； （2）仪器电源线应有良好的接地，以免发生意）仪器电源线应有良好的接地，以免发生意外；外； （3）离心机工作时不要打开顶盖；）离心机工作时不要打开顶盖； （4）电压