生物化学（上）：14核酸的物理化学性质

1、第四单元第四单元 核酸化学核酸化学第十二章第十二章 核酸通论核酸通论第十三章第十三章 核酸的结构核酸的结构 第十四章第十四章 核酸的理化性质核酸的理化性质第十五章第十五章 核酸的研究方法核酸的研究方法第第14章章 核酸的物理化学性质核酸的物理化学性质l一、核酸的水解一、核酸的水解l二、核酸的酸碱性质二、核酸的酸碱性质l三、核酸的紫外吸收三、核酸的紫外吸收l四、核酸的变性、复性及杂交四、核酸的变性、复性及杂交一一、核酸的水解核酸的水解l ( (一一) )酸水解酸水解l ( (二二) )碱水解碱水解l ( (三三) )酶水解酶水解 (一一) 酸水解酸水解l 糖苷键和磷酸酯键都能被酸水解，糖苷键和磷

2、酸酯键都能被酸水解，l糖苷键比磷酸酯键更易被酸水解。糖苷键比磷酸酯键更易被酸水解。l嘌呤碱糖苷键比嘧啶碱糖苷键对酸更不稳定。嘌呤碱糖苷键比嘧啶碱糖苷键对酸更不稳定。l对酸最不稳定的是嘌呤与脱氧核糖间的糖苷键。对酸最不稳定的是嘌呤与脱氧核糖间的糖苷键。 OO P O OO碱基碱基糖糖CH25 53 35 5 OO P O OO碱基碱基糖糖CH2OH3 3- 糖苷键和磷酸糖苷键和磷酸酯键都能被酸水解酯键都能被酸水解 糖苷键比磷酸酯糖苷键比磷酸酯键更易被酸水解键更易被酸水解嘌呤碱糖苷键比嘧嘌呤碱糖苷键比嘧啶碱糖苷键对酸更不啶碱糖苷键对酸更不稳定稳定 对酸最不稳定的对酸最不稳定的是嘌呤与脱氧核糖间是嘌

3、呤与脱氧核糖间的糖苷键的糖苷键嘌呤嘌呤或或嘧啶嘧啶（二二）碱水解碱水解 RNARNA的磷酸酯键易被碱水解，产生核苷酸，的磷酸酯键易被碱水解，产生核苷酸，DNADNA的磷酸酯键则不易被碱水解，的磷酸酯键则不易被碱水解，因为：因为：RNARNA的核糖上有的核糖上有22OHOH基，在碱的作用下形成基，在碱的作用下形成磷酸三酯（磷酸三酯（见见P P502502结构式结构式）。）。磷酸三酯极不稳定磷酸三酯极不稳定，随即水解，产生核苷随即水解，产生核苷-2-2，33环磷酸，继续水解环磷酸，继续水解成为成为2 -2 -核苷酸和核苷酸和3 -3 -核苷酸。核苷酸。DNADNA的脱氧核糖的脱氧核糖无无22OHO

4、H基，不能形成碱水解的中间产物，故对基，不能形成碱水解的中间产物，故对碱有一定的抗性。碱有一定的抗性。 RNARNA水解后生成一个水解后生成一个2 2 ，3 3环式单核苷酸中间体；中间环式单核苷酸中间体；中间体不稳定，很快转变为体不稳定，很快转变为2 2单核苷酸和单核苷酸和3 3单核苷酸单核苷酸2 -核苷酸核苷酸3 -核苷酸核苷酸（三）（三）酶水解酶水解l 水解核酸的酶种类很多。水解核酸的酶种类很多。l 非特异性水解磷酸二酯键的酶称为非特异性水解磷酸二酯键的酶称为磷酸二酯酶磷酸二酯酶（phosphdiesterasephosphdiesterase），），例如蛇毒磷酸二酯酶和例如蛇毒磷酸二酯酶

5、和牛脾磷酸二酯酶。牛脾磷酸二酯酶。l 专一水解磷酸二酯键的的酶称专一水解磷酸二酯键的的酶称核酸酶核酸酶（nucleasenuclease）。）。 见见P P503 503 图示。图示。核酸酶的分类：核酸酶的分类：l1、按底物专一性分类、按底物专一性分类: 作用于核糖核酸的称为作用于核糖核酸的称为核糖核酸酶核糖核酸酶(ribonuclease,RNase);作用于脱氧核糖核酸的称为作用于脱氧核糖核酸的称为脱氧核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶 deoxyribonuclease,DNase.l2、按对底物作用的方式可分为：、按对底物作用的方式可分为： 核酸内切酶核酸内切酶(endonuclease)与核酸

6、外切酶与核酸外切酶(exonuclease)。l3、按磷酸二酯键断裂的方式可分为两类，一种在、按磷酸二酯键断裂的方式可分为两类，一种在3 -OH与磷酸基之间断裂，另一种在与磷酸基之间断裂，另一种在5 -OH与磷酸基之间与磷酸基之间断裂。断裂。l4、其他分类标准、其他分类标准核糖核酸酶类核糖核酸酶类（1 1）牛胰核糖核酸酶）牛胰核糖核酸酶( (pancreatic ribonucleasepancreatic ribonuclease) ) （EC 2.7.7.16EC 2.7.7.16）简称）简称RnaseRnase 3535P3535PACUGPP 只作用于只作用于RNA,RNA,不作用于不

7、作用于DNADNA。 具有极高的专一性，其作用点为具有极高的专一性，其作用点为嘧啶核苷嘧啶核苷-3-3- -磷酸与其他磷酸与其他核苷酸之间的连键，产物为核苷酸之间的连键，产物为3 3- -嘧啶核苷酸或以嘧啶核苷酸或以3-3-嘧啶核苷嘧啶核苷酸结尾的寡核苷酸酸结尾的寡核苷酸。（2）核糖核酸酶）核糖核酸酶T1(ribonucleaseT1) (EC3.1.4.8) 具有比具有比Rnase更高的专一性，其作用点是更高的专一性，其作用点是3 -鸟苷酸与鸟苷酸与其相邻核苷酸的其相邻核苷酸的5 -OH的连键，产物为以的连键，产物为以3 -鸟苷酸为末端鸟苷酸为末端的寡核苷酸，或的寡核苷酸，或3 -鸟苷酸。鸟

8、苷酸。（3 3）核糖核酸酶）核糖核酸酶T T2 2( (Rnase Rnase T T2 2) ) 主要作用点为主要作用点为ApAp残基，可以将残基，可以将tRNAtRNA完全降解成完全降解成3 3 - -腺苷酸腺苷酸结尾的寡核苷酸结尾的寡核苷酸。3535P3535PAGUCPP3535P3535PACUGPP脱氧核糖核酸酶类脱氧核糖核酸酶类 （1）牛胰脱氧核糖核酸酶）牛胰脱氧核糖核酸酶（EC 3.1.4.5） (pancreatic deoxyribonuclease, DNase) 此酶切断双链此酶切断双链DNA或单链或单链DNA成为以成为以5 -磷酸为磷酸为末端的寡聚核苷酸，平均长度为末

9、端的寡聚核苷酸，平均长度为4个核苷酸，需镁离个核苷酸，需镁离子（或子（或Mn2+,Co2+）最适）最适pH7-8。用。用 0.01mol/L柠檬酸柠檬酸盐可完全抑制被镁离子激活的活性。盐可完全抑制被镁离子激活的活性。l（2）牛脾脱氧核糖核酸酶）牛脾脱氧核糖核酸酶（EC 3.1.4.6） (spleen deoxyribonuclease, Dnase)此酶降解此酶降解DNA成为成为3 -磷酸末端的寡聚核苷酸，磷酸末端的寡聚核苷酸，平均长度为平均长度为6核苷酸。最适核苷酸。最适pH4-5，需，需0.3mol/L钠钠离子激活，镁离子可抑制此酶。离子激活，镁离子可抑制此酶。l（3）链球菌脱氧核糖核酸

10、酶）链球菌脱氧核糖核酸酶 (streptococcal deoxyribonuclease, Dnase） 是内切酶，作用于是内切酶，作用于DNA，成为，成为5 -磷酸为末端磷酸为末端的寡聚核苷酸，长度不一，最适的寡聚核苷酸，长度不一，最适pH7，需镁离子。，需镁离子。 （4）限制性内切酶）限制性内切酶 在细菌中发现的这类酶，主要是降解外源的在细菌中发现的这类酶，主要是降解外源的DNA ，具有很严格的碱基序列专一性具有很严格的碱基序列专一性。如。如EcoR，不需要不需要ATP，只需要镁离子，专一性很强，能识，只需要镁离子，专一性很强，能识别别DNA上上6对碱基组成的序列，交错切割，形成的对碱基

11、组成的序列，交错切割，形成的产物产物具有粘性末端具有粘性末端。 二二、核酸的酸碱性质核酸的酸碱性质 1、碱基的解离、碱基的解离 2、核苷的解离、核苷的解离戊糖可增强碱基的酸性解离戊糖可增强碱基的酸性解离核糖中的羟基也可发生解离核糖中的羟基也可发生解离 3、核苷酸的解离、核苷酸的解离 4、核苷酸的滴定曲线（如图所示）、核苷酸的滴定曲线（如图所示）l1、碱基的解离、碱基的解离 碱基具有芳香环结构特点碱基具有芳香环结构特点: : 能发生酮式能发生酮式/ /烯醇式、氨式烯醇式、氨式/ /亚氨式互变亚氨式互变 嘌呤和嘧啶碱基都具有弱碱性嘌呤和嘧啶碱基都具有弱碱性 主要是环内氨基的贡献主要是环内氨基的贡献

12、: :l 嘧啶碱基嘧啶碱基N N1 1可接受质子，可接受质子，C C2 2的烯醇式羟基可给出质子；的烯醇式羟基可给出质子；l 嘌呤碱基嘌呤碱基N N1 1可接受质子，可接受质子， N N9 9可给出质子；可给出质子；l（AdeAde、GuaGua、CytCyt有氨基有氨基； UraUra、ThyThy无氨基无氨基，不形成两性解离），不形成两性解离）ONHNHOON-NHOCH3ONHNHOCH3ON-NHO19.5pK 19.9pK HHONH2NH+NHONH2NNHO-NH2NNH212.5pK 14.6pK HH 胞嘧啶胞嘧啶: : 尿嘧啶及胸腺嘧啶尿嘧啶及胸腺嘧啶: :酮式酮式/ /烯

13、醇式互变烯醇式互变氨式氨式/ /亚氨式互变亚氨式互变NNH+NHNNH2NNNHNNH2NNN-NNH214.15pK HH29.8pK NNHNHNH+NH2ONNHNHNNH2ONN-NHNH+NH2ONN-N-NNH2OHHH13.2pK 29.6pK 312.4pK 鸟嘌呤和次黄嘌呤中质子鸟嘌呤和次黄嘌呤中质子则结合到则结合到N7上上3、核苷酸的解离：核苷酸的解离： 由于核苷酸含有碱基和磷酸基，为由于核苷酸含有碱基和磷酸基，为两性电解质两性电解质，在，在不同的不同的pHpH溶液中解离程度不同，在一定条件下可以形成溶液中解离程度不同，在一定条件下可以形成兼性离子。核酸的碱基、核苷、核苷酸

14、均能发生解离，兼性离子。核酸的碱基、核苷、核苷酸均能发生解离，核酸的酸碱性质与此有关。核酸的酸碱性质与此有关。 磷酸基使核苷酸具有很强的酸性。磷酸基使核苷酸具有很强的酸性。三三、核酸的紫外吸收核酸的紫外吸收 核酸中的嘌呤和嘧啶环的共轭体系强烈吸收核酸中的嘌呤和嘧啶环的共轭体系强烈吸收260-290nm260-290nm波段紫外光，其最高的吸收接近波段紫外光，其最高的吸收接近260nm260nm。由于蛋白质在这一光区仅有很弱的吸收，因此可以由于蛋白质在这一光区仅有很弱的吸收，因此可以利用核酸的这一光学特性来定位测定它在细胞和组利用核酸的这一光学特性来定位测定它在细胞和组织中的分布。织中的分布。

15、纯纯DNADNA的的A A260260/A/A280280应大于应大于1.81.8，纯，纯RNARNA应达到应达到2.02.0。样品中如含有杂蛋白及苯酚，样品中如含有杂蛋白及苯酚， A A260260/A/A280280比值既明显比值既明显降低。降低。吸吸 收收 峰峰220240260280nm0.10.20.30.4123DNADNA的紫外吸收光谱的紫外吸收光谱天然天然DNADNA变性变性DNADNA核苷酸总核苷酸总吸收值吸收值波长波长四四、核酸的变性核酸的变性、复性及杂交复性及杂交l (一一)变性变性l (二二)复性复性l (三三)核酸的杂交核酸的杂交（一一）核酸的变性核酸的变性1 1、变

16、性的概念、变性的概念 2 2、热变性和、热变性和TmTm3 3、影响、影响TmTm的因素的因素变性的概念变性的概念 核酸变性核酸变性（denaturationdenaturation）指双螺旋区氢键断裂，指双螺旋区氢键断裂，空间结构破坏，形成单链无规线团状态的过程。变空间结构破坏，形成单链无规线团状态的过程。变性只涉及次级键的变化，不涉及共价键的断裂。磷性只涉及次级键的变化，不涉及共价键的断裂。磷酸二酯键的断裂称核酸降解。酸二酯键的断裂称核酸降解。 核酸变性后核酸变性后，260nm260nm的紫外吸收值明显增加，称的紫外吸收值明显增加，称增色效应增色效应。同时黏度下降，浮力密度升高，生物学。同

17、时黏度下降，浮力密度升高，生物学功能部分或全部丧失，这些性质可用于判断核酸的功能部分或全部丧失，这些性质可用于判断核酸的变性程度。变性程度。热变性和热变性和Tm（P508) 加热加热DNA的稀盐溶液，达到一定温度后，的稀盐溶液，达到一定温度后，260nm的吸光度骤然增加，表明两链开始分开，吸的吸光度骤然增加，表明两链开始分开，吸光度增加约光度增加约40%后，变化趋于平坦，说明两链已完后，变化趋于平坦，说明两链已完全分开。这表明全分开。这表明DNA变性是个突变过程，类似结晶变性是个突变过程，类似结晶的熔解，通常把的熔解，通常把加热变性使加热变性使DNA的的双螺旋结构失去双螺旋结构失去一半一半时的

18、温度时的温度称称DNA的熔点或的熔点或熔解温度（熔解温度（melting temperature）用用Tm 表示表示。熔解温度曲线熔解温度曲线DNADNA的熔解温度的熔解温度影响影响Tm的因素的因素 （1 1）DNADNA的均一性的均一性: :均质均质DNADNA熔解过程发生在一个较小的温度熔解过程发生在一个较小的温度范围内，异质范围内，异质DNADNA熔解过程发生在一个较宽的温度范围内，所熔解过程发生在一个较宽的温度范围内，所以以TmTm可以作为衡量可以作为衡量DNADNA样品均一性的标准。样品均一性的标准。 （2 2）G-CG-C对含量对含量: :G-CG-C对含对含3 3个氢键，个氢键，

19、A-TA-T对含对含2 2个氢键，故个氢键，故G-CG-C对相对含量愈高，对相对含量愈高，T Tm m愈高。愈高。 经验公式为经验公式为: : X X G+CG+C =( T =( Tm m 69.3) 69.3)2.442.44 可利用该公式计算可利用该公式计算TmTm值。值。( ( TmTm在在7070 110110之间变化之间变化） （3 3）介质中的离子强度介质中的离子强度: :离子强度较低的介质中，离子强度较低的介质中，Tm Tm 较低。较低。在纯水中，在纯水中，DNADNA在室温下即可变性。在室温下即可变性。G G+ +C C含含量量Tm6070809010002040608010

20、0TmTm值与值与G-CG-C含量的关系含量的关系(二二) 核酸的复性核酸的复性复性的概念：复性的概念：变性核酸的互补链在变性核酸的互补链在适当条件下重新缔合成适当条件下重新缔合成双螺旋的过程称双螺旋的过程称复性复性（reassociationreassociation）。变性核酸复性时需缓慢变性核酸复性时需缓慢冷 却 ， 故 又 称冷 却 ， 故 又 称 退 火退 火(annealing)(annealing)。 影响复性速度的因素影响复性速度的因素 单链片段浓度越高，随机碰撞的频率越高，复单链片段浓度越高，随机碰撞的频率越高，复性速度越快。性速度越快。 较大的单链片段扩散困难，链间错配频率

21、高，较大的单链片段扩散困难，链间错配频率高，复性较慢。复性较慢。 片段内的重复序列多，则容易形成互补区，因片段内的重复序列多，则容易形成互补区，因而复性较快。而复性较快。 维持溶液一定的离子强度，消除磷酸基负电荷维持溶液一定的离子强度，消除磷酸基负电荷造成的斥力，可加快复性速度。造成的斥力，可加快复性速度。 （三三）核酸的杂交核酸的杂交 在退火条件下，不同来源的在退火条件下，不同来源的DNADNA互补区形成双链，或互补区形成双链，或DNADNA单链和单链和RNARNA链的互补区形成链的互补区形成DNA-RNADNA-RNA杂合双链的过程称杂合双链的过程称分子杂分子杂交交(hybridization)(hybridization)。 杂交可以发生于杂交可以发生于 DNA 与与 DNA 之间，也可以发之间，也可以发生生 于于