分子生物学SectionE

1、Section EDNA ReplicationMolecular BiologyCourseE1 DNA复制概述复制概述关于关于DNA复制的基本问题：复制的基本问题：1、双螺旋、双螺旋DNA复制的基本模型复制的基本模型2、参与、参与DNA复制的蛋白质及其作用复制的蛋白质及其作用3、不同生物中的、不同生物中的DNA复制复制E1: DNA Replication: An Overview Replicons, semi-conservative, semidiscontinous, RNA primingE2: Bacterial DNA replication Experimental sys

2、tem, initiation, unwinding, elongation, termination & segregation E4: Eukaryotic DNA replication Experimental system, cell cycle, initiation, replication forks, nuclear matrix, telomere repl.E3 Cell cycle When to replicateE1: DNA Replication:An Overview1. Replicons（复制子）（复制子）2.semi-conservative m

3、echanism3.semi-discontinous replication4.RNA priming（引导）（引导）E1-1 Replicons 复制子：复制子：以单一单位复制的任一段以单一单位复制的任一段DNA。 复制从特定的位点复制从特定的位点起始点起始点开始，两个开始，两个复制叉复制叉双双向进行至向进行至终点终点。 原核生物染色体：原核生物染色体：程环形程环形 单一复制子单一复制子 一个起始点（复杂）一个起始点（复杂） E1 DNA复制概述复制概述复制起点（复制起点（origin）终点（终点（terminus）E1 DNA复制概述复制概述复制泡复制泡复制叉复制叉真核生物染色体：真核生

4、物染色体：线性线性 多复制子多复制子 多个起始点（富含多个起始点（富含AT) 复制泡复制泡 哺乳动物细胞复制子：哺乳动物细胞复制子：50000 100000个个密度标记实验密度标记实验E1 DNA复制概述复制概述E1-2 Replication is Semi-conservativeMeselson-Stahl 实验实验5353Parental strandsSemi-conservativeConservativeDispersiveDaughter strandsSemi-conservative mechanismMeselson-Stahl 实验实验14N-14N14N-15N15N

5、-15N15NH4Cl14NH4Cl20 min40 min 半保留机制半保留机制：在复制中，：在复制中，DNA双螺旋的双螺旋的两条亲代链分开，分别作为模板指导酶两条亲代链分开，分别作为模板指导酶催化的新生互补子链的合成。催化的新生互补子链的合成。 这样每个子细胞接受亲代这样每个子细胞接受亲代DNA双链中的双链中的一条。一条。5353DNA合成的底物：合成的底物：脱氧核苷三磷酸脱氧核苷三磷酸（dNTP)反应机制：反应机制：新生链新生链3端核苷酸的端核苷酸的3OH与与下一个碱基互补的下一个碱基互补的a磷原子磷原子处的处的亲核攻亲核攻击击。E1-3 Replication isSemi-disco

6、ntinuousSemi-discontinuous replication半不连续复制：半不连续复制：每个复制叉中的前导链是从起每个复制叉中的前导链是从起始点开始沿着始点开始沿着53方向连续复制，而后随链方向连续复制，而后随链是从复制叉处开始以是从复制叉处开始以53方向合成不连续的方向合成不连续的短片段（冈崎片断）。短片段（冈崎片断）。E1-4 RNA primingThe first few nucleotides at the 5-end ofOkazaki fragments are ribonucleotides. Hence,DNA synthesis is primed by R

7、NA that is thenremoved before fragments are joined. Crucialfor high fidelity of replicationF2 DNA复制机制复制机制DNA复制原则：只容许复制原则：只容许53方向进行方向进行 冈崎片段冈崎片段半不连续复制模型：前导链半不连续复制模型：前导链 后随链后随链 解旋酶（解旋酶（DNA helicase）单链结合蛋白单链结合蛋白（SSB：single-stranded binding protein）引发酶（引发酶（DNA primase）E1 DNA复制概述半不连续复制复制概述半不连续复制RNA引导引导DN

8、A 聚合酶功能：聚合酶功能：5-3聚合酶（聚合酶（polymerase）5-3外切酶（外切酶（exonuclease）3-5校正外切酶校正外切酶DNA 连接酶连接酶F2 DNA复制机制复制机制E1 DNA复制概述半不连续复制复制概述半不连续复制E2: BacterialDNA replication1. Experimental system2. initiation,3. unwinding,4. elongation,5. termination & segregationE2-1: In vitroexperimental systemsE2 细菌细菌DNA复制复制研究研究DNA

9、复制的复制的实验系统（实验系统（experimental systems）cell-free system：制备：制备DNA 必须的蛋白质和其他因子必须的蛋白质和其他因子 DNA：噬菌体（：噬菌体（ x174 /T4 /T7）和质粒）和质粒DnaBDnaCGATCTNTTNTTTTTTATNCANADnaAOriCE2 细菌细菌DNA复制：起始复制：起始基因座基因座OriC：4个个9 bp位点，与细胞膜相连位点，与细胞膜相连 复制起始复合体复制起始复合体 - DnaA（起始点结合蛋白）（起始点结合蛋白） DnaB（解旋酶）（解旋酶） SSB DnaC（装载解旋酶和引发酶）（装载解旋酶和引发酶）

10、 DNA引发酶引发酶E2-2: Initiation（起始）（起始）5533313bp直列重复直列重复49bp DnaA结合位点结合位点保守序列保守序列GATCTNTTNTTTT保守序列保守序列TTATCCACAInitiation30304040个，缠个，缠绕，负超螺旋绕，负超螺旋4 4个个9bp9bp位点，位点，DnaADnaA蛋白结合位点蛋白结合位点3 3个个13bp13bp长，长，富含富含ATATDnaBDnaB蛋白蛋白, ,解旋酶解旋酶SSBSSBDNADNA引发酶引发酶Re-initiation of bacterial replication at new origins bef

11、ore completion of the first round of replicationOriginsT（ DnaA 合成与生长速度相关）合成与生长速度相关）E2-3: UnwindingPositive supercoiling: 复制叉处螺旋转角的复制叉处螺旋转角的去除会导致分子其余部位额外转角的导去除会导致分子其余部位额外转角的导入入 .type II topoisomerase （DNA旋转酶）旋转酶）E2-4: Elongation(延伸）延伸）引发体：引发体：包含包含DnaB解旋酶和解旋酶和DNA引物酶引物酶DNA聚合酶聚合酶III全酶：全酶：二聚体二聚体(Mg2+,dNT

12、P, 53 , 3-OH末端引物链末端引物链,模版链模版链)单体单体 a亚基聚合酶作用亚基聚合酶作用 亚基外切核酸酶亚基外切核酸酶:35校正作用校正作用 亚基将聚合酶结合到亚基将聚合酶结合到DNA上上 其它亚基不同其它亚基不同,合成长或短的合成长或短的DNADNA聚合酶聚合酶I：切除引物，填补切除引物，填补DNA 53 聚合酶聚合酶 53 外切酶外切酶 35 校正外切核酸酶酶校正外切核酸酶酶 DNA连接酶：连接酶：催化磷酸二酯鍵催化磷酸二酯鍵E2 细菌细菌DNA复制：延长复制：延长Pol III 5533Pol III E2 细菌细菌DNA复制：延长复制：延长SSBDnaB解旋酶解旋酶引发体（

13、引发体（primosome）Pol I、连接、连接酶酶DNA引物酶引物酶3 55DNA旋转酶旋转酶Elongation: lagging strand replicationE2-5: Termination andSegregation（终止与分离）（终止与分离）Tus protein: ter binding protein, an inhibitor of the DnaB helicaseTerminationE2 细菌细菌DNA复制：终止复制：终止AATTAGTATGTTGTAACTAAAGTTTAATCATACAACATTGATTTCAterD / terAterC / terBR

14、eplication fork 1Replication fork 2tus gene 产物产物复制终止区：复制终止区：200 kbtus gene 产物产物：DnaB 解旋酶的抑制剂解旋酶的抑制剂 拓扑异构酶拓扑异构酶解联解联 随随膜附着点移动膜附着点移动而分开而分开E4: EukaryoticDNA replication1. Experimental system2. initiation,3. replication forks,5. telomere replication.DNA复制复制E4 真核生物真核生物DNA复制：起始复制：起始实验系统实验系统DNA：酵母（：酵母（14000

15、 kb / 400复制子）、复制子）、SV40cell-free system：非洲爪蟾：非洲爪蟾复制起始复制起始 早：常染色质，中：异染色质，晚：着丝点和端粒早：常染色质，中：异染色质，晚：着丝点和端粒 自动复制序列自动复制序列（ARS); 起始点识别复合体起始点识别复合体（ORC)E3-3: Replication fork &elongationReplication forkE4 真核生物真核生物DNA复制：延伸和终止复制：延伸和终止相关酶和蛋白质相关酶和蛋白质解旋酶解旋酶单链结合蛋白单链结合蛋白（RP-A，replication protein A）延伸酶延伸酶- DNA P

16、ol （核内（核内,引发酶活性）引发酶活性） - DNA Pol （核内（核内,主要复制酶主要复制酶,前导链前导链/后随链延长后随链延长, 3-5校正活性）校正活性） - DNA Pol （?核内核内, 可能引物去除后滞后链缺口合成可能引物去除后滞后链缺口合成, 3-5校正活性）校正活性） - DNA Pol (核内核内,损伤修复损伤修复) - DNA Pol (线粒体中线粒体中,线粒体线粒体DNA复制复制, 3-5校正活性校正活性)连接酶连接酶 I（DNA ligase I）Replication factories: all the replication enzymes, DNA in

17、replication胸腺嘧啶类似胸腺嘧啶类似物物溴脱氧尿苷溴脱氧尿苷核基质（核基质（nuclear matrix） 复制工厂（复制工厂（DNA、蛋白质）、蛋白质）E4 端粒复制端粒复制关于端粒的两个问题：关于端粒的两个问题： 1. 复制后产生粘性末端（复制后产生粘性末端（sticky end）、染色体不稳定）、染色体不稳定 2. 染色体末端染色体末端DNA短缩短缩端粒酶端粒酶：150核苷酸核苷酸RNA分子，且部分与端粒序列互补；分子，且部分与端粒序列互补； RNA作为模板，通过反复延伸和易位，将重作为模板，通过反复延伸和易位，将重 复片断加到复片断加到3端。端。其它其它DNADNA复制方式复制方式Supplemental 1E5 其他环状其他环状 DNA复制方式复制方式滚环形（滚环形（rolling circle）-单向复制单向复制 单链模板、单链模板、 3-OH缺口缺口噬菌体噬菌体/ 细菌细菌F因子因子 3-OH5-P5Supplemental 1D- 环型（环型（D-loop） -单向复制单向复制 双链复制不同步双链复制不同步动物线粒体动物线粒体 / 植物叶绿体植物叶绿体DNA基因组基因组E5 其他环状其他环状 DNA复制方式复制方式HLSupplemental 2E1: DNA Replication: An Overview Replicons, semi-c