油橄榄果渣多酚提取实验方案

1、油橄榄果渣多酚提取实验方案一、 油橄榄果渣预处理（一）油橄榄果渣的脱油1有机溶剂浸提法（油橄榄果渣油的提取工艺及其脂肪酸组成研究）1.1原料、仪器及试剂原料：油橄榄鲜果渣，用前在-20冰箱封存。仪器：BS210S 型电子分析天平，DHZ -C 型大容量恒温振荡器，N -1001 型旋转蒸发仪。试剂：正己烷为分析纯试剂; 实验用水为去离子水。1.2实验步骤准确称取10 g 粉碎后的油橄榄果渣，置于250mL具塞三角瓶中，按1:9的料液比加入溶剂; 将三角瓶置于55（50）的恒温振荡器中振荡提取，转速200 r /min（150 r /min），时间为3h; 用过滤法分离溶剂混合物与残渣，用一定量

2、（5+5mL）溶剂洗涤残渣2 次，收集脱油油橄榄果渣，干燥至恒重（真空干燥：40，12h），计算脱油率。2.酶法（酶法辅助提取工艺对橄榄油品质的影响）2.1原料、仪器及试剂原料：油橄榄鲜果渣，用前在-20冰箱封存。仪器：BS210S 型电子分析天平，DHZ -C 型大容量恒温振荡器，N -1001 型旋转蒸发仪、磁力搅拌器（可加热）、高速离心机。试剂：纤维素酶; 实验用水为去离子水。2.2实验步骤准确称取10 g 粉碎后的油橄榄果渣，置于250 ml具塞三角瓶中，加入1.0%( W/W) 的纤维素酶水溶液10 ml，置于50的恒温振荡器中振荡提取，转速150 r /min，时间为45min，4

3、 000 r /min 离心20 min，去上层油脂，收集下层脱油的果渣，干燥至恒重（真空干燥：40，12h），计算脱油率。（二）油橄榄果渣的干燥1.油橄榄果渣的冷冻干燥1.1 原料、仪器及试剂原料：用上述油橄榄脱油果渣，用前在-20冰箱封存。仪器：BS210S 型电子分析天平，冷冻干燥机。1.2 实验步骤 将原料果渣放入冷冻干燥机，冷冻干燥预冷冻时间为24h，在干燥时间分别为12、24、36、48h的条件下对样品进行冷冻干燥处理，对所得样品进行粉碎，选过80目筛的样品进行多酚提取操作，以多酚得率为指标确定最适宜干燥时间。2.油橄榄果渣的真空干燥2.1 原料、仪器及试剂原料：油橄榄脱油果渣，用

4、前在-20冰箱封存。仪器：BS210S 型电子分析天平，真空干燥机。2.2 实验步骤2.2.1 干燥温度对油橄榄果渣得率的影响 将原料果渣放入真空干燥机，分别在温度为30、40、50、60条件下对样品进行真空干燥处理12h，然后对所得样品进行粉碎，选过80目筛的样品进行多酚提取操作，以多酚得率为指标确定最适宜真空干燥温度。2.2.2 干燥时间对油橄榄果渣得率的影响 将原料果渣放入真空干燥机，在温度为40，干燥时间分别为6、12、18、24h条件下对样品进行真空干燥处理，然后对所得样品进行粉碎，选过80目筛的样品进行多酚提取操作，以多酚得率为指标确定最适宜真空干燥时间。3.油橄榄果渣干燥工艺的确

5、定根据以上实验结果，选择最佳干燥方式和条件，作为油橄榄果渣干燥工艺。（三）油橄榄果渣的粉碎1.原料、仪器及试剂原料：用上述干燥后油橄榄果渣，用前在-20冰箱封存。仪器：BS210S 型电子分析天平，超微粉碎仪，分样筛（60、80、100、120目）。2实验步骤将原料果渣放入超微粉碎仪中粉碎一定时间后取出，分别用60、80、100、120目的分样筛对样品进行筛分，制得不同粒度的果渣样品，对这些果渣样品进行多酚提取操作（乙醇60%，料液比1：30，55，2h），以多酚得率为指标确定最适宜的样品粒度。二、 油橄榄多酚的提取（一） 溶剂法提取油橄榄多酚1.实验材料、仪器及试剂材料：经上述预处理的油橄榄

6、果渣，用前在-20冰箱封存。仪器：UV754紫外可见分光光度计(上海分析仪器总厂)，ZFQ85A旋转蒸发器(上海医械专机厂)，电子天平，高速离心机，100ml容量瓶（磨口）及配套的冷凝管，橡胶管，温度计、水浴锅、移液管（5ml、10ml、25ml）、洗耳球、容量瓶（100ml）、酒精比重计。 试剂：乙醇（分析纯）、丙酮（分析纯）、蒸馏水。2.乙醇浸提法提取油橄榄多酚2.1 试验方法2.1.1 单因素实验 (1)浸提温度比较试验精确称取1.0 g干燥橄榄粉末4份，分别加入70乙醇30 mL，分别在30、50、70、90（20、35、50、65）下浸提2 h，提取2次，离心，收集上清液，定容到10

7、0mL。(2)乙醇浓度比较试验精确称取1.0 g干燥橄榄粉末4份，分别加入30、50、70、90乙醇30 mL，50下浸提2 h，提取2次，离心，收集上清液，定容到100mL。(3)料液比比较试验精确称取1.0 g干燥橄榄粉末4份，分别加入50乙醇10、20、30、40 mL，50下浸提2h，提取2次，离心，收集上清液，定容到100mL。(4)浸提时间比较试验精确称取1.0 g干燥橄榄粉末4份，加入50乙醇30 mL，50下分别浸提1、2、3、4h，提取2次，离心，收集上清液，定容到100mL。(5)提取次数比较试验精确称取1.0 g干燥橄榄粉末4份，加入50乙醇30 mL，50下浸提2 h，

8、分别提取1次、2次、3次、4次，离心，收集上清液，定容到100mL。以上各处理均重复3次。2.1.2 优化实验 根据单因素试验与分析结果，选择有现实作业意义的因素水平构建正交试验表进行主因素优化试验，并进行统计分析，得出最佳实验组合。3.丙酮提取油橄榄多酚3.1 试验方法3.1.1 单因素实验 (1)浸提温度比较试验 精确称取1.0g干燥橄榄粉末4份，分别加入70 丙酮30 mL，分别在20、3O、50、70（20、35、50、65）下浸提2 h，提取2次，离心，收集上清液，定容到100mL。(2)丙酮浓度比较试验精确称取1.0g干燥橄榄粉末4份，分别加入50、60、70、80丙酮30 mL，

9、50下浸提2 h，提取2次，离心，收集上清液，定容到100mL。(3)料液比比较试验精确称取1.0g干燥橄榄粉末4份，分别加入50丙酮10、20、30、40 mL，50下浸提2h，提取2次，离心，收集上清液，定容到100mL。(4)浸提时间比较试验精确称取1.0g干燥橄榄粉末4份，加入50丙酮30 mL，50 下分别浸提1、2、3、4h，提取2次，离心，收集上清液，定容到100mL。(5)提取次数比较试验精确称取1.0g 干燥橄榄粉末4份，加入50丙酮30 mL，50下浸提2 h，分别提取1次、2次、3次、4次，离心，收集上清液，定容到100m L。以上各处理均重复3次。3.1.2 优化实验

10、根据单因素试验与分析结果，选择有现实作业意义的因素水平构建正交试验表进行主因素优化试验，并进行统计分析，得出最佳实验组合。4.最终提取方案确定 根据以上实验结果，选择最佳提取溶剂和提取工艺，作为超声波和微波处理法提取油橄榄果渣多酚的辅助提取方法。（二） 超声波法提取油橄榄多酚1实验材料、仪器与试剂材料：经上述预处理的油橄榄果渣，用前在-20冰箱封存。仪器：UV754紫外可见分光光度计(上海分析仪器总厂)， JY88超声波细胞粉碎机(上海新芝生物技术研究所)。 试剂：蒸馏水、乙醇或丙酮（分析纯） 2. 单因素试验2.1 超声波功率对油橄榄果渣多酚提取效果的影响 称取1.0g经上述果渣预处理后的油

11、橄榄果渣粉，按上述溶剂提取法中最佳溶剂和提取方法加入最佳溶剂，分别在功率为60、70、80、90W，提取时间25min的条件下进行油橄榄果渣的提取，根据多酚得率选出最佳的超声波提取功率。2.2 超声波时间对油橄榄果渣多酚提取效果的影响称取1.0g经上述果渣预处理后的油橄榄果渣粉，按上述溶剂提取法中最佳溶剂和提取方法加入最佳溶剂，在功率为80W，提取时间分别为15、25、35、45min的条件下进行油橄榄果渣的提取，根据多酚得率选出最佳的超声波提取时间。（三） 微波处理法提取橄榄多酚1实验材料、仪器与试剂材料：经上述预处理的油橄榄果渣，用前在-20冰箱封存。仪器：UV754紫外可见分光光度计(上

12、海分析仪器总厂)， Galanz中型机械微波炉(顺德格兰仕电器有限公司)。 试剂：蒸馏水、乙醇或丙酮（分析纯） 2. 单因素试验2.1 微波功率对油橄榄果渣多酚提取效果的影响 称取1.0g经上述果渣预处理后的油橄榄果渣粉，按上述溶剂提取法中最佳溶剂和提取方法加入最佳溶剂，分别在功率为260、270、280、290W（改为200、400、600、800W），提取时间5s的条件下进行油橄榄果渣的提取，根据多酚得率选出最佳的微波提取功率。2.2 微波时间对油橄榄果渣多酚提取效果的影响（橄榄中黄酮微波提取工艺研究）称取1.0g经上述果渣预处理后的油橄榄果渣粉，按上述溶剂提取法中最佳溶剂和提取方法加入最

13、佳溶剂，在功率为280W，提取时间分别为4、5、6、7s（改为1、5、10、15min）的条件下进行油橄榄果渣的提取，根据多酚得率选出最佳的微波提取时间。（四）油橄榄果渣多酚提取最优工艺的确定 根据以上实验结果，以油橄榄果渣多酚得率为指标，确定油橄榄多酚提取的最佳方法以及工艺条件。三、 油橄榄多酚的分离纯化（油橄榄叶中多酚和黄酮的含量分析）（一）大孔树脂法1树脂的筛选通过测定以下型号树脂LX-1、XAD-7、XAD-16、AB-8、HPD-200、LS-100的吸附和解析能力确定树脂。2树脂的动态试验（橡实壳多酚分离纯化、抗氧化剂抑菌的研究（中南林业科技大学 郑菲 硕士论文）2.1 吸附动态试

14、验（1）pH值对吸附的影响（3、4、5、6、7、8）（2）上样量对吸附的影响（1、2、3、4、5BV/h）（3）动态吸附曲线的绘制2.2 解析动态试验（1）乙醇浓度对洗脱效果的影响（30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%）（2）洗脱剂的体积对洗脱效果的影响（1、2、3、4、5BV/h）（3）动态解吸曲线的绘制取干燥好的油橄榄果渣30g，采用最佳提取工艺进行提取，将提取液在30下旋转蒸发除去溶剂，回收溶剂，浓缩后样品加水稀释至100 mL，用石油醚等体积萃取3次，石油醚层浓缩，回收石油醚，水层上大孔树脂柱( 20 am×50 cm)进行柱层析。柱层析方法如下：取处理好的

15、250 mL D101大孔树脂，装入层析柱内。样品溶液慢慢滴人层析柱，漏出液的速度为4 mL/min。用23倍柱体积的水淋洗树脂至流出液呈无色，以洗去其中的多糖等水溶性杂质，再用70 的乙醇溶液600 mL缓缓通过树脂柱，控制其流速，收集洗脱液。30下旋转蒸发除去乙醇，水相冷冻干燥，得油橄榄叶提取物精制产品，于-20下保存备用，测定多酚的含量。（称取1/4、1/5精制产品分别定容至25mL） 四、 油橄榄多酚的分析鉴定：紫外吸收光谱、红外光谱、高效液相色谱1.初步定性分析：香草醛-盐酸法、明胶试验法（橡实壳多酚分离纯化、抗氧化剂抑菌的研究（中南林业科技大学 郑菲 硕士论文） 2、UV分析：以甲

16、醇溶剂为参比，在190900 nm范围内测定提取物质的紫外吸收光谱。3HPLC色谱分析条件：色谱柱Zorbax SBC，8(946 mm × 250 mm，孔径5 m)，柱温30 ，流速1 mL/min，进样量10L，检测波长280 nm；流动相：甲醇水醋酸(体积比10：90：0580：20：05)，洗脱梯度030 min。（橄榄多酚的提取研究）五、 油橄榄多酚含量的测定（一）分光光度法（橄榄总多酚提取工艺优化研究）1.各种溶液的配制：(1)没食子酸母液：精确称取没食子酸500 mg，溶于蒸馏水中，定容至100 mL作为母液，分别吸取2.5、5.0、7.5、l0.0、l2.5、15.

17、0 mL于25 mL容量瓶中，用蒸馏水定容，制备成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/mL的标准液。（精确称取没食子酸125 mg，溶于蒸馏水中，定容至25 mL作为母液，分别吸取1、2、3、4、5、6 mL于10 mL容量瓶中，用蒸馏水定容，制备成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/mL的标准液。）(2)pH 7.5磷酸缓冲液1/15 mol/L的磷酸氢二钠溶液(A液)：称取磷酸氢二钠(GB1263)23.877 g，加水溶解并定容至1 L。1/15 mol/L的磷酸二氢钾溶液(B液)：称取经110烘干2 h的磷酸二氢钾(GB1274)9.073 g，加水溶解

18、并定容至1 L。取A液85 mL和B液15 mL混匀，即得pH 75的缓冲液。(3)酒石酸铁溶液：称取硫酸亚铁(GB664)0.1 g，酒石酸钾钠(GB1288)0.5 g，加水溶解定容至100 mL，此液可稳定l0天。2.标准曲线的绘制吸取不同浓度的标准液和对照品160uL于5 mL离心管中，加入酒石酸铁溶液800uL，加磷酸缓冲液至4 mL，用水代替没食子酸作为对照，用1 cm的比色皿，在540nm处测定吸光度(A)，用吸光度与对应的浓度进行线性回归，得标准工作曲线。3.多酚含量测定准确吸取待测液160uL，加入酒石酸铁溶液800uL，加磷酸缓冲液至4 mL，用水代替没食子酸作为对照，测定

19、样品的吸光度，代入线性回归方程，得到样品多酚含量，计算提取得率。计算公式如下：多酚提取得率=C*VW*Vt*1000×100其中：C提取液中多酚含量(mgmL)；V定容体积(mL)； W样品质量(g)；Vt提取液体积(mL)。（二）FolinCiocalteu反应比色法1FolinCiocalteu试剂配制：将100g钨酸钠(Na2WO4 ·2H2O), 25g钼酸钠( Na2MoO4·2H2O) ,700 mL蒸馏水，50 mL 85%磷酸及100 mL浓盐酸装入带回流装置的2000mL圆底烧瓶中，充分混合，文火缓慢回流10h,在加入150g硫酸锂(Li2SO4

20、),50 mL蒸馏水及数滴液溴，然后将烧瓶内溶液开口煮15min，以驱除过量的溴，冷至室温后用容量瓶定容至1000mL，过滤。滤液呈微绿色。 吸取10 mL 1 moL/ mL的NaOH溶液，放入100 mL锥形瓶内，加入2滴酚酞指示剂，用上述滤液滴定。当溶液的颜色由绿经紫红到紫灰，到突然转变成墨绿色即为滴定终点。根据滴定所用的滤液量计算其酸度(相当于2 moL/ L HCL溶液)。将滤液稀释到H+浓度为1 moL/ L，此液即为FoLin酚试剂。将其置于棕色试剂瓶内，保存在冰箱中。用前稀释2倍。（SngiloetnV.L;Rossi,J.A.Colorimetry of totatl Phe

21、nolics with PhosPhomolybdic一PhosPhotungstic acid reagentsJ.Am.Enol.Vitic.1965，16:144一158）2.测定波长的选择（FolinCiocalteu试剂比色法测定橄榄中多酚含量的研究） 取油橄榄果渣提取液和没食子酸溶液各1ml，分别与各比色试剂混合均匀并定容至25ml，室温避光放置2h,以空白作为对照，用紫外分光光度计在400900nm波长范围内扫描，确定最强烈的吸收峰，以选择测定波长。3.标准曲线的绘制精确称取0.0140g的干燥没食子酸标准品，用蒸馏水溶解，定容于100mL的容量瓶中，配成浓度为140mgL的没食

22、子酸溶液。然后分别精密吸取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0和6.0mL没食子酸标准溶液定容于10mL容量瓶内，配成浓度为084mgL的系列标准溶液。再从各标准溶液中吸取1mL加人25mL容量瓶内，加10mL蒸馏水，摇匀，再加15mLFolinCiocalteu试剂，充分摇匀30s后，8min前加入6mL 10Na CO 溶液，混匀，加水定容，再混匀，然后在30下避光放置反应2h，以0样为空白，在由前面确定的波长处测定吸光值，以吸光度值为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。4测定方法（均匀设计法优化橄榄叶多酚提取工艺）取1mL橄榄果渣多酚提取稀释液于25mL容量瓶内，加

23、10mL蒸馏水，摇匀，再加15mLFolinCiocaheu试剂，摇匀，在放置30s后加入6mL 10Na2CO3溶液，450s内加完，混匀，加水定容，再混匀，然后在30下避光反应2h，在相关波长处测定吸光值，根据测得的标准曲线线方程计算橄榄叶提取液中多酚含量(以没食子酸计)，经进一步计算即得多酚提取得率。提取得率y= CV/N×100式中：y：提取得率()；C：提取原液中多酚的浓度(mg/L)；V：提取多酚液总体积(mL)；M：橄榄果渣质量(g)。六、体外抗氧化活性测定（橄榄中多酚类物质体外抗氧化活性研究）6.1还原力的测定在25mLpH=66的磷酸盐缓冲液中加入不同浓度的试样溶液

24、25mL，1 的铁氰化钾溶液25mL，混合物在50o【=恒温20min后，再加入25mL 10 的三氯乙酸溶液，然后以3000r/min离心分离10rain，取上清液5mL加蒸馏水5mL和01FeC1 溶液1mL，在700nm处测定吸光度AToo。用蒸馏水作无还原能力对照(调仪器零点)，抗坏血酸、BHT作为还原能力对照。每个试样作三次平行试样，取其平均值。6.2 橄榄多酚提取物对羟基自由基·OH的清除作用参照Fenton反应的方法建立反应体系模型，在6支试管中分别加人浓度均为6.0mmol/LFe2+ 、水杨酸一乙醇溶液各1.0mL，分别加入1.0mL浓度分别为0.28mg/mL、0

25、.42mg/mL、0.56mg/mL、0.70mg/mL、0.84mg/mL、0.98mg/mL的样品溶液，加蒸馏水至5.0mL，再分别加入6.0mmol/LH2O2 1.0mL，10min后以蒸馏水为参比，于510nm处测吸光度值，代入公式计算清除率。P = (A0-Ai)/A0×100。式中：A0一试剂空白液的吸光度；Ai一加提取液后的吸光度6.3 橄榄多酚提取物对超氧阴离子自由基(O ·)的清除作用取4.5mLTrisHC1缓冲溶液，于25水浴中放置20min，分别加入lmL不同浓度的试验溶液和0.4mL 25mmolL的邻苯三酚溶液，混匀后，于25水浴中反应5rain，然后加入8mmol/L的HC1溶液lmL终止反应，然后在420nm处测定吸光度A1 ，空白以蒸馏水代替样品液，测定吸光度A0。每个试样作三次平行试样，取其平均值。按下式计算清除率：O2-清除率() =(A0-A1)/A0×1006.4 橄榄多酚提取物清除亚硝酸盐(NO2-；)的实验取不同浓度的样品