生化,分子,细胞试验汇总

1、主要培养基的配制LB液体培养基胰蛋白胨 10 g，酵母浸出物 5 g，氯化钠 10 g，蒸馏水 1000 ml，用 1 mol/L HCl 调节 pH 至 7.4，121高压灭菌 20 min。如果需要加抗生素，则待灭过菌的培养基温度降到 55以下后加入适量的抗生素储存液。LB 固体培养基在LB液体培养基中加入2%琼脂。DMEM细胞培养基DMEM溶液90%(v/v)，FBS 10%(v/v)，青霉素100U/ml，链霉素100 mg/mlMcCoys 5A细胞培养基McCoys 5A溶液90%(v/v)，FBS 10%(v/v),青霉素100 U/ml，链霉素100 mg/ml实验试剂及药品的

2、配制1 mol/L Tris-HCl (pH8.0)在800 ml的双蒸水中溶解Tris(三羟甲基氨基甲烷)121.1 g，用浓盐酸调pH至8.0，用双蒸水定容至1000 ml。121高压灭菌15 min，备用。TE 缓冲液(pH8.0)1 mol/L Tris-HCl(pH8.0)10 ml和500 mmol/L EDTA(pH8.0)溶液2 ml，用双蒸水定容至1000 ml。121高压灭菌15 min，备用。500 mmol/L 乙二铵四乙酸二钠(EDTA)溶液(pH8.0)在 800 mL 的双蒸水中加入18.6 g 乙二铵四乙酸二钠，充分溶解后，用10 mol/L NaOH 溶液调p

3、H 至8.0，用双蒸水定容到1000 ml。121高压灭菌 15 min，备用。溴化乙锭(EB)1 g EB，加入100 ml 灭菌双蒸水中，磁力搅拌数h以确保其完全溶解，然后转入棕色瓶中，4保存。TAE 电泳缓冲液(50×)242 g Tris碱，57 ml冰乙酸，100 ml 0.5M EDTA，加灭菌去离子水定容至 1000 ml，使用时稀释50倍。10% SDS将10 g高纯度的SDS置于烧杯中，加入约 80 ml的ddH2O，68加热溶解，滴加盐酸调节pH值至7.2，定容至100 ml后，室温保存。G418 (Neomycin)用PBS (pH 7.4) 配成浓度为50 m

4、g/ml的原液，0.22 mm滤膜过滤除菌，分装储于-20备用。基因组DNA提取液1 mmol/L Tris-HCl (pH8.0)1 mL和0.1 mol/L EDTA (pH8.0)溶液20 ml， 0.5% (m/v) SDS，加灭菌去离子水定容至100 ml，备用。蛋白提取液1M Tris-HCl (pH7.6) 5 ml，5 M NaCl 3 ml，10%SDS 1 ml，100% NP-40 1 ml，加灭菌去离子水定容至100 ml，备用。100 mM 姜黄素用DMSO配成浓度为100 mM的储存液，分装避光储存于-20备用。100 mM CPT-11CPT-11原装瓶为50 m

5、g，加入802 ml DMSO溶解，分装储存于-20备用。100 mM DHADHA原装瓶为50 mg，加入1758 ml DMSO溶解，配成浓度为100mM的储存液，分装避光储存于-20备用。100 mM 5-Fu用DMSO配成浓度为100 mM的储存液，分装避光储存于-20备用。实验方法细胞冻存（HEK293细胞为例）1. 消化细胞并700rpm离心5min收集细胞；2. 吸除上清，沉淀用冻存培养基（80% DMEM，10%FBS，10%DMSO，现配现用）充分重悬；3. 将细胞悬液分装至冻存管中，1ml/管，标注细胞名称/型号、代数、日期、操作者，并迅速放于室温的冻存盒内；4. -80过

6、夜，然后转移至液氮罐中冻存。细胞复苏（HEK293细胞为例）1. 将冻存的细胞迅速从液氮罐中取出，放入37水浴中进行溶解至无冰晶；2. 将细胞悬液转移至15ml无菌离心管中。逐滴加入5ml完全培养基，边滴加边充分摇动；3. 700rpm离心5min收集细胞；4. 吸除上清以2ml完全培养基来重悬细胞沉淀并转移到6孔板中进行培养。总RNA提取1) 弃12或6孔板中的原Medium后，PBS 500 ul/孔洗两次.2) TRIzol 1 ml/孔（组织经匀浆处理后每100 mg加入1ml的Trizol）。吹打混匀后转移到相应的做好标签的好的1.5 ml的离心管中，并立即放在冰上以防RNA降解，5

7、 min.3) 氯仿 200 ul/管，剧烈震荡15 s （Dont Vortex！），使细胞充分裂解,室温静止3 min.4) 4，12000 rcf，15 min.5) 转移500 ul上清到相应的做好标记的1.5 ml的离心管中，加入500 ul/管异丙醇，颠倒混匀，室温静止10 min。4，12000 rcf，15 min.6) 弃上清，加入用DEPC水配好的75%的乙醇1 ml/管，颠倒两次后，放4离心机，7500 rcf，5 min.7) 弃上清，等RNA干燥透明后加入30 ul的DEPC水，吹打混匀使得RNA溶解后，1% 凝胶电泳分析（100V 15-20 min），置于-80冰

8、箱保存。基因克隆1. 查找目标基因的基本信息，查找相关文献，设计克隆基因方案。利用DNA处理软件和引物设计软件设计引物，将引物序列送公司合成，根据合成引物的退火温度确定PCR退火温度。2. 查询该基因有表达的细胞株，培养细胞，采用Trizol法提取总RNA。3. 反转录。4. PCR：首先进行预实验，跑胶初步判断大小，摸索最佳退火温度和体系。然后进行回收目标片段。5. 连接18T vector：载体和插入片段的比例为1:3。6. 转化感受态细胞，筛选单克隆。7. 挑取单克隆至1ml LB液体培养基（含抗生素）中，37，300rpm，约1012 h，小抽并且进行酶切验证。8. 测序：挑取酶切验证

9、正确的阳性克隆送测序。9. 根据测序结果，将测序正确的片段连接入真核表达载体。实验室有多种表达载体，根据需要选择。连接体系参考T4Ligase 说明书。10. 连接产物转化感受态，挑选阳性克隆进一步酶切验证，挑取阳性克隆中抽质粒并纯化，瞬转真核细胞（根据课题的方向选择细胞株），Western Blot验证所构建的表达载体是否在该细胞株中表达。11. 大抽，操作步骤详见说明书。中抽质粒（基因克隆时酶切验证时所用方法）1）6000 rpm，离心5 min（4），弃上清;2）重复步骤1），收集34ml菌液至1个EP管中；3）加入2.5 ml 预冷的solution ，吹打混匀，充分悬浮细菌；4）加入

10、2.5 ml 现配的solution ，轻柔颠倒几次，充分混匀（solution 配置：0.4 M NaOH：2% SDS=1：1）；5）加入3.5 ml预冷的solution ，轻柔颠倒几次，充分混匀，中和裂解液的碱性；6）冰浴10 min，使杂质充分沉淀；7）12,000 rpm 离心10 min（4），轻轻吸取上清800 l/管，转移至干净的1.5 ml离心管中；8）加入2/3 体积的异丙醇（530 l），混匀后冰浴5 min；9） 12,000 rpm离心10 min，弃上清；10）预冷的70% 乙醇溶液 750l/管洗涤DNA沉淀，12,000 rpm离心10 min（4）；11）弃

11、上清，晾干，每管加入30 l TE(含20lg/ml RNase)，65 ，5 min；去除RNA；12）将几管合并至一管，加等体积酚、氯仿混合液(成品)，剧烈振荡10 s；13） 12,000 rpm离心10 min，取上清；14）加入1/10体积的3 M NaAc 和2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，即1ml；15）12,000 rpm 离心10 min，弃上清；16）70% 乙醇水溶液洗涤DNA沉淀，12,000 rpm离心10 min，弃上清；17）用适量ddH2O或者TE溶解DNA沉淀，得比较纯净的DNA，测浓度。琼脂糖凝胶电泳1) 配制足量的电泳缓冲液（1xTAE 或0.5xTBE）用

12、以灌满电泳槽或配制凝胶；2) 根据欲分离DNA片段的大小用电泳缓冲液配适宜浓度的琼脂糖溶液：准确称量琼脂糖干粉加到盛好电泳缓冲液的玻璃瓶中；3) 玻璃瓶松松盖住，沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖溶化；4) 用隔离手套转移玻璃瓶到55箱内后，待溶化的凝胶稍冷却后加入EB，终浓度为0.5 ug/ml,轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液；5) 琼脂糖冷却时，用一合适的梳子形成加样孔，梳齿的位置应在托盘底面上0.5-1.0 mm,这样琼脂糖浇灌到托盘时将形成符合要求的加样孔；6) 浇灌温热的琼脂糖溶液进入模具；7) 让胶完全凝结，室温下30-45min,小心拔出梳子，将凝胶安放到电泳槽中；8) 向电泳槽中加入电泳

13、缓冲液，刚好没过凝胶1 mm；9) 混合DNA样品和0.2倍体积的6xloading buffer,用微量移液器将样品混合液缓慢加至加样孔中；10) 1关上电泳槽盖子，接好电极插头，设好电压和时间，按Run键，DNA应向阳极移动；11) 当DNA样品或染料在凝胶中迁移了足够距离时，关上电源、拔下插头和打开电泳槽盖，取出胶放入凝胶成像仪中拍照。RT-PCR1) 根据所测的RNA的浓度，计算上样500 ng的RNA样品所需的体积，用DEPC 水补至5 ul，加入1 ul的6xloading buffer进行电泳：120V、15 min。2) 根据所测的RNA的浓度，计算上样2 ug RNA样品所需

14、的体积，用DEPC水补至5 ul随机引物1 uldNTP4 ulRNA5 ul65 5min5 x buffer4 ulInhibitor0.5 ulRTase1 ulDEPC水4.5 ul30 10min42 50min70 15min4 foreverPCR产物胶回收1) 按照普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书步骤，制备含大加样孔的1%琼脂糖凝胶电泳，将PCR产物加入加样孔。2) 电泳结束后，在320nm波长紫外灯下根据Marker指示快速切取目的片段，用纸巾转移至Ep管，秤取其重量。3) 加入相应体积的溶胶液Buffer DE-A，水浴锅75加热至凝胶完全融化（约6-8min）。4)

15、加入Buffer DE-B，混合均匀。5) 将上步骤的所得液体加入DNA制备管中12,000×g离心1min，弃滤液。6) 加入500ul Buffer W1，12,000×g离心30s，弃滤液。7) 加700ul Buffer W2，12,000×g离心30s，弃滤液。8) 以同样的方法再用700ul Buffer W2洗涤一次，12,000×g离心1min。9) 将制备管置于洁净的1.5ml离心管，在制备膜中央加25-30ul Eluent Buffer，室温静置1min。12,000×g离心1min洗脱DNA。感受态细胞的制备1. 准备L

16、B培养基和LB平板。2. 取冻存的Ecoli,37 融解后接种于LB平板上，37 培养16-20h。3. 在平板上挑取单菌落（2-3mm）,转到含有100mlLB培养基的1L的烧瓶中，37 剧烈振荡培养（250-300r/min）3h。4. 去1.5mlEp管，加入1mlLB培养基，再加入200ul菌液，37 振荡孵育过夜（300rpm/min）。5. 在无菌的500ml烧瓶中加入50mlLB培养基，加入0.5-1 ml 培养过夜的的菌液（即稀释50-100倍），然后与37 300r/min 振荡孵育OD600=0.6(0.4-0.6)(约2h)。6. 当菌液密度达到0.6以后，将菌液在冰上放

17、30min.。7. 将菌液在转入50ml离心管，4 2500rpm, 离心20min,弃上清。8. 将沉淀用25ml预冷的0.1M Cacl2 重悬，按步骤7重复一次，弃去Cacl2 溶液。9. 用2ml 预冷的0.1M Cacl2 重悬沉淀（轻柔），然后在冰上放置1h.。10. 在重悬的菌液中加入丙三醇（甘油）（15% v/v）(即857ul 50%灭菌甘油)，充分混匀后分装，200ul或100ul每管（1.5mlEp管），-80保存。感受态细菌的转化1) -80中取出已制备好的感受态菌，冰上放约20 min。2) 去1 ul质粒加入1个感受态管中，混匀，放冰上约30 min。3) 将混合液

18、放入已加温至42的循环水浴中，90 s（其间，不要摇动管子）4) 快速转到冰浴中，3 min。5) 加800 ul不含任何抗生素的培养基于每管，37，120 r/min，摇1h。6) 取100 ul菌涂板于含有相应抗生素的LB培养板上，37培养箱中倒置平板培养12-14 h，出现菌落。SDS碱裂解法制备质粒DNA（小抽）1) 取1 ml LB培养液加入1个1.5ml的EP管中，挑一个单菌落于该管中，37，120300r/min，摇过夜，800ul用于提取质粒，200ul保留。2) 6000 rpm，5min，弃上清。3) 加入250 ul预冷solutionI/管，充分混匀，重悬细菌。4) 加

19、入新配制的solutionII 250 ul/管，反复颠倒(轻轻5-10次)混匀5次，以混合内溶物，室温静止3-5 min。5) 加入350 ul/管的solutionIII，快速反复颠(轻轻5-10次)倒混匀后，冰浴10 min。6) 12000 rpm，5 min，取上清750 ul转移到新的1.5 ml的EP管中。7) 加入500 ul(2/3)体积的异丙醇，充分混匀后冰浴5min,沉淀DNA。8) 12000 rpm，10 min，弃上清。9) 加入预冷的70%乙醇润洗除盐，12000 rpm，10min3min，弃上清。10) 加入10 ul含RNase的TE融解DNA，65反应10

20、min(37反应1 h)11) 质粒检测。中抽质粒1) 取小抽剩下的200 ul菌液转入50ml的含Amp+的LB培养基中，37，300rpm,摇约16h。2) 6000 rpm，5min,弃上清，收集菌体。3) 加入2.5ml预冷solutionI/管，重悬菌体。4) 加入新配制的solutionII 2.5ml /管，反复颠倒混匀5次，以混合内溶物，室温静止3-5min。5) 加入3.5ml /管的solutionIII，快速反复颠倒混匀后，冰浴10min。6) 12000rpm,10min,取800ul/管上清于新的1.5 ml的EP管中。7) 加入2/3体积（533.3ul）的异丙醇，

21、充分混匀后室温放5min。8) 12000rpm，3min，弃上清。9) 加入预冷的70%乙醇700ul/管，润洗除盐，12000rpm，10 min，弃上清。10) 质粒DNA晾干透明后，加入300ul/管含RNase的TE融解DNA（65反应5min）11) 加入等体积300 ul的（苯酚:氯仿=1:1）剧烈震荡10s，然后4，12000rpm，10min。12) 吸取上清于另一管中，加入1/10体积的3M NaAC,两倍体积的无水乙醇，混匀后室温放置3min。13) 4，12000rpm，10min，弃上清，加入预冷的70%乙醇润洗除盐。14) 加入合适体积的含RNase的TE融解DNA

22、（200ul）。15) 质粒检测。大抽质粒（QIAGEN试剂盒）挑取单菌落于300 ml LB培养液中，250rpm，摇过夜，约12-16h.4000rpm，5min，收集沉淀。加入8ml预冷solutionI/管，剧烈震荡至沉淀重悬。加入新配制的solutionII 16ml /管，轻轻混匀5次，以混合内溶物，室温静止5min。加入12ml /管的solutionIII，轻轻混匀，冰上放置15 min。4，12000rpm，20min。若离心不紧密，再离心一次。将上清用擦镜纸过滤于小的管中，加0.6-1倍体积的异丙醇，充分混匀，室温放置20min.4，12000rpm,20min,弃上清。用

23、70%的乙醇洗管底和管壁3次，若沉淀漂起重新离心，放于架子上晾至乙醇挥发干净。加400ulTE(PH 8.0)充分溶解后，转移到1.5 ml 的EP管中。质粒纯化1）质粒酶切后加入200 ul ddH2O，然后加入100 ul 酚/氯仿，剧烈震荡混匀；2) 4, 12000 rpm, 15 min；3)转移上清至一新EP管中，加入1/10体积的3 M NaAC和2倍体积的无水乙醇，充分混匀（直接从大抽质粒纯化时，100 ul质粒（不够，ddH2O补齐）+10 30 ul 3 M NaAC + 200 ul无水乙醇）；4) 4, 12000 rpm, 10 min；5)用预冷的75%乙醇洗3次（

24、4, 12000 rpm, 5 min每次）；6)用75%乙醇装满，拿进细胞房，倒掉乙醇，风干5-6 min（不超过10 min，否则难溶）；7)加入20-40 ul 1xTE buffer（已过滤除菌）充分溶解；8)测浓度，分装，-204保存。细胞DNA抽提1) 吸弃去培养液，用PBS洗两次（6孔板中）；2) 加1 ml细胞裂解液、40 ul 20 mg/ml的蛋白酶K、10ul的10mg/ml的RNaseA，用封口膜封好，再用保鲜膜包好后，55烘箱过夜；3) 2 ml异丙醇沉淀DNA，摇匀后，用枪将DNA 挑起放入新的1.5 ml EP管中；4) 75%酒精沉淀两次，12000 rpm，5

25、min，再用100%的酒精洗一次；5) 晾干后，加入1xTE 100 ul 溶解过夜。鼠尾中DNA的提取1) 在含有约0.5 cm 小鼠尾巴的EP管中加入600 ul 50 mM的NaOH；2) 在金水浴中90-100煮1 h；3) 加入50 ul pH 8.0的Tris/HCl后，颠倒混匀；4) 12000 rpm，20 min；5) 取上清500 ul于另一做好标记的管中。Real-time PCR1. SYBR检测方法：（请注意2.5xRealMasterMix和20xSYBR solution避光保存）1) 20xSYBR solution在室温下平衡并彻底混匀。2) 将125 ul

26、20xSYBR solution 加入至1.0 ml 2.5x RealMasterMix中。（加入20xSYBR solution的2.5xRealMasterMix溶液在-20可以保存三个月。在使用前务必彻底混匀RealMasterMix/SYBR solution。如果解冻后并没有使用，一定要注意在再次冷冻前彻底混匀。反应体系组成成分50 ul体系25 ul体系20 ul体系终浓度2.5xRealMasterMix /20xSYBR solution22.5 ul11.25 ul9 ul1x正向引物100-300nM反向引物100-300nMDNA模板-ng-pg超纯水至50 ul至25

27、 ul至20 ul2PCR检测反应步骤（建议）循环步骤温度时间内容1x194-951-2min起始模板变性35-45x294-9510-20sPCR循环中模板变性350-6010-30s退火46810-60s延伸（解链时间的长短与模板的长度和GC含量有关）2. 引物稀释：引物总浓度为1 mM，体积：200 mlddH2O 180 ulPrimer 1 (20 uM)10 ulPrimer 2 (20 uM)10 ulTotal200 ul3. SYBR mixture与template的混合：SYBR mixture9 ulDNA template1 ulTotal10 ul4. 操作流程：1

28、） 加人10 ul 稀释好的primer至管底2） 加入10 ul SYBR mixture与template的混合物3） Vortex and Spin down4） 放入仪器检测5. PCR程序95 2 min40x95 15 s60 30 s68 30 s95 15 s溶解曲线60 1 min95 15 s60 15s40x*68收集荧光6. 仪器的使用(1) 建立文件1） 打开7300 software2） 点击Create New document3） Next4） Next5） 点击Create New File6） Add files （e.g. Actin, PDE4DIP）t

29、o the right box7） Next8） Select wells9） Finish10) Name11) Done(2) 检测1）打开菜单栏中的Instrument2）Edit program （将默认program的后两项删除->add step->输入数值->add step->program输入完成，点击add dissociation stage->下方下拉框中选择Data collection为68）3）Save file至指定文件夹4）放入样品5）点击Start6）程序完成后关闭software和仪器注意事项：1） 先开仪器，设好progra

30、m再开始配制试剂2） 使用SYBR mixture一定要先恢复到室温3） 配制试剂尽量避光（超净工作台操作）4） 检测用的PCR管盖不能标记、及用手碰触，带手套操作5） 冰上配制，PCR管先预冷6） 荧光产物很容易污染，不能随便打开盖子，要丢弃指定位置7） 使用无RNA酶的耗材操作Western blot检测1) 配制分离胶和浓缩胶；2) 加样电泳：向凝固好的加样孔中加入等量的蛋白，在电泳槽中进行电泳，采用恒压模式，初始电压为50 V，待样品进入分离胶后电压增至100 V，根据蛋白大小决定电泳时间；3) 转膜前准备：提前10 min将PVDF膜浸泡在甲醛甲醇中，滤膜和海绵浸泡在转膜液中；4)

31、转膜：按照以下顺序装配转膜装置：负极海绵滤纸凝胶PVDF膜滤纸海绵正极，将转膜装置放入电转槽中，将电转槽置于4冰箱，40 V恒压12 h (蛋白>250 kDa，50V，16 h)；5) 封闭：转膜结束后取出PVDF膜，在正面做好标记，将膜置5%脱脂奶粉中室温封闭1-3 h；TBST洗膜 洗3次，每次10 min；6) 一抗孵育：加入稀释好的一抗，室温孵育2-3 h；7) TBST洗膜 洗3次，每次10 min15/5/5/5；8) 二抗孵育：二抗用5%封闭液按1：1000-5000稀释，室温孵育2-3 h；9) TBST洗膜 洗3次，每次10 min；10) 曝光显影：将膜蛋白面与荧光

32、混合液充分接触；孵育10 min，使用镊子将膜轻轻转移到另一保鲜膜上，将残存的底物吸干，包好，放入X-光片夹中固定好，取大小适中的感光片盖在膜上，曝光15 s/1 min/3 min；11) 定影：将X-光片从光片夹中取出，在显影液中浸泡30s，取出，浸入定影液中，以胶片透明为止，用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。显影和定影的具体步骤及注意事项（要点：均匀、快速）:1) 将底物（Bio-Rad）按1:1混合（1.5 ml + 1.5 ml）；2) 二抗孵育洗膜后将膜至于面巾纸中，快速轻压一下，取出至于底物混合液中；3) 将膜快速浸湿其中一面，然后镊子提取翻转，浸湿另一面；4) 室温避光放

33、置5 min；5) 将膜取出沾一下面纸以吸走多余底物；6) 将膜置于保鲜膜上，包好，放置于暗夹中；7) 暗房中，取出X-光片，抵住暗夹一侧，快速连同暗夹盖子一起合上；8) 曝光时间结束，将暗夹倒转放置，打开盖子，快速取出X-光片置于显影液中；9) 均匀充分显影后将X-光片至于定影液中；10) 定影结束用自来水清洗轻柔漂洗X-光片。Transfection（Lipofectamine 2000）1）Seed 8x105 HEK293 cells to 6-well plate and culture overnight;2) Change medium to pre-warmed Opti-ME

34、M 1 h (or medium with PS 3 h) before transfection;3) Prepare following solution:A: 4 ug DNA plasmid + 250 ul Opti-MEM B: 10 ul lipofectamin + 250 ul Opti-MEM Incubate for 5 min at RT;4) Mix A and B gently, and incubate for 20 min at RT;5) Add DNA/lipo mixture onto cells;6) After incubation for 4-6 h

35、, change medium without PS.稳转克隆的筛选1）细胞转染24 h后1:5分到10 cm plate（分盘比例根据不同细胞、不同质粒调整）；2）细胞培养12-14 d至克隆形成，每3天更换含G418的培养基；3）加入20 ul 胰酶至96-well plate；4）挑克隆至含有胰酶96-well plate，37孵育3-5 min；5）加入200 ul培养基，细胞培养至密度达80%以上；6）PCR鉴定，具体步骤如下：(1) 往标记好的PCR管中加入5 l 50mM NAOH；(2) 往96孔板的每孔中加入20 l不含酚红的胰酶，37消化10 min；(3) 从96孔板取2

36、 l细胞悬液加入到(1)中，在PCR仪中100度5 min后暂停，加入0.6ul的1M Tris PH 7.6再根据如下程序裂解细胞，提取基因组DNA作为PCR反应模板：CycleTemperatuer ()Time (seconds)1653028303659049718058606651807976086560980300 (4) PCR鉴定体系：取1 l裂解产物作为模板进行PCR扩增:ddH2O14.2 l10x PCR Buffer2 lDNTP Mixture2 lP1(上游引物)(20uM)0.3 lP2(下游引物)(20uM)0.3 lDNA Polymerase0.2 lTem

37、plate1 lTotal20 l*引物的用量可根据具体情况调整PCR产物进行凝胶电泳检测，直到找到所需单克隆。7）往96孔板中剩下的细胞加入200 l/孔新的完全培养基，转移到新的96-well plate中继续培养；8）PCR阳性克隆继续培养，96well 48 well 24well 12well 6well。当细胞长满1个6孔时，将细胞1:2分成2个6孔，其中一个孔的细胞用于蛋白提取和Western blot验证，另外一个孔的细胞冻存。siRNA干扰实验转染试剂使用lipofectamin 2000，所有耗材均为RNase free.1) Seed 1 x 105 cells to 1

38、2-well plate and culture for 24 h;2) Prepare following solution:A (Mock): 50 ul Opti-MEM B (Non-targeting): control siRNA 50 nmol + 50 ul Opti-MEMC (siRNA): siRNA 50 nmol + 50 ul Opti-MEMD (Lipo): 3*3 lipofectamin +150 ul Opti-MEM Incubate for 5 min at RT;3) Add 50 ul D to A or B or C, and incubate

39、for 20 min at RT;4) Add 200 ul Opti-MEM to RNA/lipo mixture;5) Add 300 ul RNA/lipo mixture onto cells;6) After incubation for 6 h change medium without PS;7) If needed, re-transfect the cells with siRNA 48 h later.Colony formation assay 1）24 h after transfection, count cells;2) Seed cells in triplic

40、ate in 6-well plate;3) Culture for 10-12 days, change medium with G418 every three days;4) Wash cells gently with PBS;5) Fix the cells with pre-chilled methanol (-20), 10 min, RT;6) Remove methanol, add 1 ml 0.5% crystal violet diluted in 20% methanol, 15 min, RT;7) Wash the plate with tag water gen

41、tly;8) Air dry the plate and count the colonies.MTT assay1) Seed cells in triplicate in 96-well plate (2000-3000 cells/well);2) Culture for 1-7 days, change medium every three days;3) Add 20 ul MTT stock solution (5 mg/ml) to cells;4) Incubate for 4-6 h at 37;5) Remove the medium and add 100 ul DMSO

42、 to dissolve the formazan;6) The absorbance was measured at a wavelength of 570 nm.划痕实验1）用marker笔在6孔板背面用尺子比着划5道横线；2）铺适量细胞于6孔板中；3）细胞密度达95%用200 ul进口枪头比着直尺划3道垂直直线（贴壁不牢的细胞可改用10 ul的枪头）；4）PBS洗3遍以去除漂浮细胞；5）加入1 ml培养基，拍照（取样点为交叉点的上下位置）；6）加入含10%FBS培养基继续培养（FBS的量可根据不同细胞调整）；7）每12 h或24 h拍照。Transwell assay1) Cell cu

43、ltured to 80-90% confluence;2) Starve the cells overnight (12 h);3) Equilibrium the transwell insert with medium without FBS at 37 for at least 1 h or overnight;4) Trpsinize the cells and adjust the density to be 1 x106/ml with medium containing 0.1% BSA and no FBS;5) Add 100 ul cells (1x105) to tra

44、nswell insert in medium containing 0.1% BSA and no FBS;6) Add 600 ul medium containing 10% FBS to lower chamber;7) Incubate for 24 h;8) Wash the cells with PBS;9) Fix the cells with pre-chill methanol (-20);10) Stain the cells with 0.5% crystal violet diluted in 20% methanol for 10 min;11) Wash the

45、inserts with PBS 3x (Plate the insert in wells containing PBS);12) Carefully remove the cells on upper site of the membrane with cotton sticks;13) Count the cells under microscopy.Note: Medium used in this assay without PS!裸鼠成瘤实验实验动物：4-5周龄nu /nu裸鼠购于维通利华；裸鼠长至6-8周龄进行肿瘤接种。所需细胞量：5 x 106 x 8只x 2=8 x 107

46、约8个10 cm plates (2倍的细胞量)细胞处理：1) 小心吸去培养基，10 ml PBS洗一次；2) 每个10 cm 盘加入1.5 ml 0.25%的胰蛋白酶消化，RT 5 min；3) 用新鲜培养基重悬细胞，转至50 ml离心管，800 rpm离心5 min；4) 吸去培养基，用30 ml PBS重悬细胞，充分吹成单个细胞(先加4 ml PBS吹散细胞，再加26 ml PBS上下颠倒混匀)；5) 细胞计数，计数完成后算出细胞总量，800 rpm 离心5 min，6) 用PBS调整细胞密度为为5×107个/ml，吹打成单细胞悬液，细胞放置于冰上(避免冰中有水，快速低温半小时

47、之内接种于裸鼠体内)；7) 将细胞接种于裸鼠左臀大肌背侧，100 ml/只 (即5×106细胞/只)。裸鼠接种：1) 皮下麻醉注射，酒精棉球消毒皮肤，针头刺入，进针4/5，即可注射，注射完成快速抽出针头，镊子轻镊注射口10 s，以防细胞因压力而溢出；2) 裸鼠接种后放回笼子做好标记裸鼠均给予自由饮水、饮食，SPF饲养。肿瘤的测量:1) 接种后每天定时观察与记录裸鼠精神、饮食及排便等状况，用电子天平称量裸鼠体重；2) 用游标卡尺测量移植瘤的最大直径(L)和最小直径(W)，肿瘤体积用公式V = L ×W2×0.5326 计算，从第4天开始测量，之后2天测量一次，同时测

48、量体重；3) 接种20-28天后，肿瘤体积达1000-1500 mm3，裸鼠处死，取瘤称重，肿瘤放置液氮或-80ºC保存。细胞周期实验1.细胞准备1）铺3.5x105细胞于6孔板，培养24 h；2）血清饥饿24 h；3）用含10%FBS血清继续培养24 h；4）加入400 ul Trypsin消化细胞；5）加入含10%FBS血清终止消化，1000 rpm，5min；6）用1 ml PBS重悬细胞，1000 rpm，5min；7）小心吸走全部PBS，再准确加入1 ml PBS重悬细胞（吹打30下左右）；8）转移细胞悬液至2.5 ml预冷的无水乙醇中，充分混匀（吹打30下左右）；9）-2

49、0°C固定过夜（我们做到此部；打包好用干冰快递至上海营养所）；2.染色与检测（上海营养所完成）：1）1500 rpm，5 min离心收集细胞；2）用500 ul PI-solution（用PBS将2.5 mg/ml的PI stock solution稀释成50 ug/ml PI-solution工作液）重悬沉淀；3）加入0.1 mg/ml RNase A和0.05%Tritin X-100，37°C孵育40 min；4）加入3 ml PBS，1500 rpm，5 min；5）弃上清，500 ul PBS重悬沉淀并检测。细胞免疫荧光染色盖玻片的处理：酒精擦拭干净2% HCl

50、12 h流水冲洗蒸馏水冲洗3遍95%酒精灭菌烘干除非特别说明，否则操作均在室温进行：1) Place sterilized coverslips into the 6-well plate.2) Add 500 µl of the gelatin-coating solution (0.1% in ddH2O) onto the coverslips and incubate for 10 min.3) Remove the gelatin-coating solution and air dry the coverslips for 15 min.4) Wash the cover

51、slips with PBS 5) Plating the cells onto the coverslips.6) Transect the cells and culture for 24 h-48 h.7) Wash the cells with PBS once and fixed them with 1 ml 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS for 20 min. 8) Wash the cells briefly with ice cold PBS, 3 times.9) Block excess aldehyde groups of the ce

52、lls with 1 ml 0.1 M glycin for 10 min. 10) Wash briefly with PBS, 3 times.11) Permeablize the cells with 1 ml PBS-0.5% TX-100 for 10 min. 12) Wash 3 times with PBS-0.1% TX-100, 5 min each.13) Block the cells with 1 ml 2% BSA in PBS-0.1% TX-100 (ABDB) for 10 min.14) Add 200 ml diluted primary antibod

53、y (0.5-5 mg/ml) in ABDB and incubate in a humidified chamber for 1 h at RT or at 4°C overnight.15) Wash 3 times with PBS-0.1% TX-100, 5 min each.16) Add 200 ml diluted secondary antibody (1-5 mg/ml) in ABDB to the wells and incubate for 2 h in the dark.17) Rinse 3 times with PBS-0.1% TX-100, 5

54、min each.18) DAPI staining: add 500 µl of the 0.5 g/ml DAPI solution (碧云天C1002, 1 ul stock+1 ml ddH2O+9 ml PBS) to each well and incubate for 1 min. 19) Rinse once with PBS and once with water.20) Carefully take out the coverslips from the wells and blot to remove any excess water.21) Give 10 m

55、l of 抗荧光淬灭封片液(碧云天 P0126) onto the glass slide. 22) Mount the coverslip with the cells facing towards the microscope slide and leave it overnight at 4°C.23) Visualize using a fluorescence microscope. Slides can also be stored in a slide box at < -20 °C for later examination.免疫组化实验玻片的处理：洗干净泡酸水洗95%乙醇烘干0.05%多聚赖氨酸处理（用10 ul枪头涂片，干了再涂，共3遍）1）组织福尔马林固定12 h；2）组织经组织处理机处理过夜（12-13 h）；3）石蜡包埋；4）切片机切片（4-6 um）；5）切片放进50°C水浴，完全伸展后捞片；6）65°C固定 2 h或55&#