盐酸胺溴索无菌检验方法学验证

1、盐酸胺溴索无菌检验方法学验证河北凯威制药有限责任公司1.验证目的根据中国药典2010版要求，当建立药品的无菌检查法时，应进行方法的验证，以证明所采用的方法适合于该药品的无菌检查。2.验证依据依据中国药典2010版附录 H 无菌检查中薄膜过滤法。3.验证结果的判定标准采用薄膜过滤法检查，当实验菌不大于100cfu，阳性对照有菌生长，阴性对照无菌生长，判定实验有效。比较供试品和阳性对照中试验菌的生长情况，供试品各试管中的试验菌在规定时间内均应生长良好。若同时满足上述条件，则表明供试品在所实验的条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，可以按照此验证方法进行供试品的无菌检查。4.验证材料滤器：北京牛

2、牛基因技术有限公司菌种：金黄色葡萄球菌【CMCC (B)26003】枯草芽孢杆菌 【CMCC (B)63501】大肠埃希菌 【CMCC (B)44102】生孢梭菌 【CMCC (B)64941】白色念珠菌 【CMCC (F)98001】黑曲霉 【CMCC (F)98003】购自中国药品生物制品检定所。培养基及试剂：营养琼脂培养基、改良马丁琼脂培养基、硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基（青岛日水）。稀释剂、冲洗剂：0.1%无菌蛋白胨水溶液样品：盐酸胺溴索注射液，规格1ml:75mg，批号：141001-2、141002-1、141003-1、5.验证实施5.1.菌液制备取金黄色葡萄球菌、大肠埃

3、希菌与枯草芽孢杆菌新鲜培养物接种营养肉汤，30-35培养18-24h，取上述液体培养物1ml加入9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释制成含菌数小于100cfu/ml的菌悬液备用。取生孢梭菌的新鲜培养物接种硫乙醇酸盐液体培养基30-35培养 18-24h，取上述培养物1ml，加入9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释制成含菌数小于100cfu/ml 的菌悬液备用。取白色念珠菌新鲜培养物接种改良马丁培养基，23-28培养24-28h，取上述培养物1ml，加入9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释制成含菌数小于100cfu/ml 的菌悬液备用。取经培养一周的黑曲霉斜面培养物，加含

4、0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液5ml，洗下孢子，取1ml加入9ml含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至约为小于100cfu/ml备用。5.2.活菌计数取上述方法制备的六种试验菌的菌悬液，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌接种至营养琼脂平板，每种菌接种2个平板，每平板1ml，白色念珠菌、黑曲霉接种至改良马丁琼脂平板2个，每平板1ml，置23-28培养72h，分别计数，取两平板的均值作为最终计数结果。活菌计数结果见下表。表1. 活菌计数（cfu/ml）菌种10-5稀释10-7稀释1212金黄色葡萄球菌4641大肠埃希菌5663枯草芽孢杆菌

5、3240生孢梭菌4348白色念珠菌6164黑曲霉27345.3.验证方法供试液制备：取供试品，每10支为一组，全部吸出溶液转移至1瓶装量为100ml/瓶的0.1%无菌蛋白胨水溶液中，充分混匀，作为供试液。操作方法：实验组：取封闭式滤器（3连套筒），用少量稀释液润湿滤膜，每个滤筒中分别加入制备好的供试液，过滤，用0.1%无菌蛋白胨水溶液冲洗，每个滤筒冲洗3次，每次100ml，在最后一次冲洗液中分别加入各试验菌。阳性对照：取少量稀释液湿润滤膜，不过滤供试品溶液，其它操作同实验组，作为阳性对照。阴性对照：取少量稀释液湿润滤膜，加入100ml稀释液，过滤后分别加入硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基1

6、00ml，作为阴性对照。培养观察：硫乙醇流体培养基置30-35，改良马丁培养基置23-28，培养5天，逐日观察结果。实验结果见下表：表2.样品实验结果盐酸胺溴索注射液样品批号：141002-1菌种菌数cfu/ml冲洗次数100ml/次实验结果培养基硫乙醇酸盐流体培养基改良马丁培养基培养天数1 2 3 4 51 2 3 4 5金黄色葡萄球菌443实验组阳性阴性+ + + + +- - - - -大肠埃希菌593实验组阳性阴性+ + + + +- - - - -枯草芽孢杆菌363实验组阳性阴性+ + + + +- - - - - 生孢梭菌453实验组阳性阴性+ + + + +- - - - -白色

7、念珠菌633实验组阳性阴性- + + + +- - - - -黑曲霉303实验组阳性阴性- + + + +- - - - -表中“+”表示肉眼观察有菌生长，“-”表示肉眼观察无菌生长。根据以上验证结果，当冲洗量为300ml时，每张滤膜过滤10支供试品，六种试验菌均生长良好，实验组与阳性对照无肉眼可见差异。重现试验：取另两批供试品，按每张滤膜过滤10支样品，冲洗量300ml，对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉试验重复两次。试验结果见下表。验证结论：阳性对照均有菌生长，阴性对照均无菌生长，表明试验有效。经过3批供试品的验证试验，当每张滤膜冲洗液用量为300ml

8、时，样品的过滤量10支时，实验组和阳性对照组的各个试验菌生长良好，没有明显差别，说明在该检验条件下供试品无抑菌作用或抑菌作用可忽略不计，选用金黄色葡萄球菌为阳性对照菌。表3.样品实验结果盐酸胺溴索注射液样品批号：141001-2菌种菌数cfu/ml冲洗次数100ml/次实验结果培养基硫乙醇酸盐流体培养基改良马丁培养基培养天数1 2 3 4 51 2 3 4 5金黄色葡萄球菌3实验组阳性阴性+ + + + +- - - - -大肠埃希菌3实验组阳性阴性+ + + + +- - - - -枯草芽孢杆菌3实验组阳性阴性+ + + + +- - - - - 生孢梭菌3实验组阳性阴性+ + + + +-

9、 - - - -白色念珠菌3实验组阳性阴性- + + + +- - - - -黑曲霉3实验组阳性阴性- + + + +- - - - -表中“+”表示肉眼观察有菌生长，“-”表示肉眼观察无菌生长。表4.样品实验结果盐酸胺溴索注射液样品批号：141003-1菌种菌数cfu/ml冲洗次数100ml/次实验结果培养基硫乙醇酸盐流体培养基改良马丁培养基培养天数1 2 3 4 51 2 3 4 5金黄色葡萄球菌3实验组阳性阴性+ + + + +- - - - -大肠埃希菌3实验组阳性阴性+ + + + +- - - - -枯草芽孢杆菌3实验组阳性阴性+ + + + +- - - - - 生孢梭菌3实验组阳性阴性+ + + + +- - - - -白色念珠菌3实验组阳性阴性- + + + +- - - - -黑曲霉3实验组阳性阴性- + + + +- - - - -表中“+”表示肉眼观察有菌生长，“-”表示肉眼观察无菌生长。6.无菌检查：方法：取本品，经薄膜过滤法处理，用0.1%无菌蛋白胨水溶液分次冲洗（没膜300ml）