动物细胞融合和单克隆抗体的制备

1、(1)(1)(2)(3)(4)(5)植物体细胞杂交植物体细胞杂交杂杂种种植植株株融合的融合的原生质原生质体体ABAB再再生生出出细细胞胞壁壁脱脱分分化化愈愈伤伤组组织织再再分分化化植物细胞的融合植物细胞的融合植物组织培养植物组织培养植物细胞植物细胞A原生质体原生质体B原生质体原生质体A杂种杂种细胞细胞AB去去 壁壁去去 壁壁人人工工诱诱导导方法？方法？促进融合促进融合的的方法方法？融合融合完成完成的的标志标志植物细胞植物细胞B 植物体细胞杂交技术植物体细胞杂交技术过程过程动物细胞与植物细胞的差别：提示：基本结构、全能性无细胞壁全能性受限制，不能发育成杂种动物动物细胞融合与植物体细胞杂交的不同：

2、不需去除细胞壁不能发育成新的动物个体一、动物细胞融合（细胞杂交）1、概念：指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。2、结果：形成单核的杂交细胞3、原理： 细胞膜的流动性4、诱导方式物理法：离心、振动、电激化学法：聚乙二醇（PEG)生物法：灭活？的病毒不同不同DNADNA的两个细胞的两个细胞灭活病毒诱导细胞融合灭活病毒诱导细胞融合融合后的细胞融合后的细胞进行有丝分裂进行有丝分裂5、动物细胞融合过程5、过程：动物细胞A动物细胞B诱导，融合2个完整的杂交细胞AB有丝分裂（膜融合、质融合）（核融合）注意：动物细胞的融合也需要把多个两种细胞放在一起，让它们随机融合后，再从中筛选杂交细胞6、意义：突破

3、了有性杂交方法的局限，使远缘杂交（种间、属间、科间、动植物之间）成为可能。7、应用：成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段 特别是利用杂交瘤技术制造单克隆抗体主要用于制备主要用于制备单克隆抗体单克隆抗体获得杂种植株获得杂种植株用途用途物理、化学方法物理、化学方法（同左）（同左）灭活的病毒灭活的病毒物理（离心、物理（离心、振动、电刺激）振动、电刺激）化学（聚乙二醇）化学（聚乙二醇）诱导方法诱导方法使细胞分散后诱使细胞分散后诱导细胞融合导细胞融合去除细胞壁后诱去除细胞壁后诱导原生质体融合导原生质体融合细胞融合前的处理细胞融合前的处理细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞膜的流动性、

4、细胞膜的流动性、植物细胞全能性植物细胞全能性原理原理动物细胞融合动物细胞融合植物体细胞杂交植物体细胞杂交比较项目比较项目植物、动物细胞融合的比植物、动物细胞融合的比较较二、单克隆抗体传统的抗体生产办法及缺陷是什么？抗体由什么细胞产生？已免疫B淋巴细胞每个效应每个效应B细胞只分泌一种化学性质单一、特异性细胞只分泌一种化学性质单一、特异性强的抗体强的抗体要想获得大量的单一抗体，必须克隆单一的B淋巴细胞，形成细胞群1975，米尔斯坦和柯勒 杂交瘤技术设计方案：设计方案：一个效应一个效应B B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体淋巴细胞只分泌一种特异性抗体小鼠小鼠骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞能无限增殖能无限增殖- -

5、化学性质单一、特异性强的抗体。化学性质单一、特异性强的抗体。杂交细胞杂交细胞2.2.制备过程：制备过程：诱导其融合的方法有哪些？诱导其融合的方法有哪些？融合后培养液中有几种细胞融合后培养液中有几种细胞怎样筛选出杂交瘤细胞，杂交怎样筛选出杂交瘤细胞，杂交瘤细胞有何优点瘤细胞有何优点注射抗原的目的是什么注射抗原的目的是什么为何要进行克隆化培养和专为何要进行克隆化培养和专一抗体检测，多次筛选一抗体检测，多次筛选大量增殖杂交瘤细胞获得单大量增殖杂交瘤细胞获得单抗的方法抗的方法单克隆抗体的制备中，获得能产生特定抗体单克隆抗体的制备中，获得能产生特定抗体的杂交瘤细胞是关键。当已免疫的的杂交瘤细胞是关键。当

6、已免疫的B淋巴细胞与骨淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合的过程中，将会形成多种细胞的混髓瘤细胞融合的过程中，将会形成多种细胞的混合体，包括合体，包括B淋巴细胞、骨髓瘤细胞、淋巴细胞、骨髓瘤细胞、BB融合融合细胞、骨髓瘤细胞、骨髓瘤骨髓瘤融合细胞、骨髓瘤融合细胞、B骨髓瘤骨髓瘤融合细胞（即杂交瘤细胞）和细胞多聚体（容易融合细胞（即杂交瘤细胞）和细胞多聚体（容易死亡，无需筛选），如何从混合细胞中提取到杂死亡，无需筛选），如何从混合细胞中提取到杂交瘤细胞呢？我们通过下面的例题进行说明。交瘤细胞呢？我们通过下面的例题进行说明。下图是制备分泌抗下图是制备分泌抗X抗体的过程，根据图解回抗体的过程，根据图解回答问题：

7、答问题： 1）图中有）图中有A、B两次筛选过程，其中两次筛选过程，其中A过程目的是筛选出过程目的是筛选出 ，B过程目的是筛选出过程目的是筛选出 。（2）请根据以下信息，设计一方法（不考虑机械方法）从培养液中筛选出杂交瘤细胞）请根据以下信息，设计一方法（不考虑机械方法）从培养液中筛选出杂交瘤细胞。已知细胞合成。已知细胞合成DNA有有D和和S两种途径，其中两种途径，其中D途径能被氨基嘌呤阻断。人淋巴细胞有途径能被氨基嘌呤阻断。人淋巴细胞有这两种这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖；鼠骨髓瘤细胞中虽然没有的合成途径，但一般不分裂增殖；鼠骨髓瘤细胞中虽然没有S途径，但能途径，但能不断分裂增殖。将这

8、两种细胞在试管中混合，加聚乙二醇促融，获得杂种细胞。不断分裂增殖。将这两种细胞在试管中混合，加聚乙二醇促融，获得杂种细胞。方法：方法： 。原理：原理： 。答案：（答案：（1）杂交瘤细胞）杂交瘤细胞 能产生特定抗体的杂交瘤细胞能产生特定抗体的杂交瘤细胞（2）方法：培养液中加入氨基嘌呤，收集增殖的细胞）方法：培养液中加入氨基嘌呤，收集增殖的细胞原理：加入氨基嘌呤后，使原理：加入氨基嘌呤后，使D合成途径阻断，仅有合成途径阻断，仅有D合成途径的骨髓瘤细胞及其彼此合成途径的骨髓瘤细胞及其彼此融合的细胞就不能增殖，但人淋巴细胞和骨髓瘤细胞整合后的杂种细胞可以利用淋巴融合的细胞就不能增殖，但人淋巴细胞和骨髓

9、瘤细胞整合后的杂种细胞可以利用淋巴细胞中的细胞中的S途径合成途径合成DNA而增殖。而增殖。【解析解析】从不同种类细胞中筛选出杂交瘤细胞一般要经过两次筛选。第一次筛选（图中从不同种类细胞中筛选出杂交瘤细胞一般要经过两次筛选。第一次筛选（图中A过程）：目前常采用过程）：目前常采用HAT选择培养基筛选杂交瘤细胞。其原理是：选择培养基筛选杂交瘤细胞。其原理是：DNA的合成有的合成有D和和S两两种途径。种途径。B淋巴细胞具有淋巴细胞具有D和和S两种两种DNA合成途径，但一般不分裂增殖；骨髓瘤细胞只有合成途径，但一般不分裂增殖；骨髓瘤细胞只有一种一种DNA合成途径，即合成途径，即D途径，可无限增殖；杂交瘤

10、细胞具有途径，可无限增殖；杂交瘤细胞具有D和和S两种两种DNA合成途径，合成途径，它利用其中任何一个途径都可无限增殖。由于它利用其中任何一个途径都可无限增殖。由于HAT选择培养基是在普通培养液中加入氨基选择培养基是在普通培养液中加入氨基嘌呤配制而成，由于氨基喋呤可阻断嘌呤配制而成，由于氨基喋呤可阻断D途径，仅有途径，仅有D合成途径的骨髓瘤细胞及其彼此融合合成途径的骨髓瘤细胞及其彼此融合的细胞不断增殖，而且的细胞不断增殖，而且B淋巴细胞一般不增殖，淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂交瘤细淋巴细胞一般不增殖，淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂交瘤细胞可以利用淋巴细胞中的胞可以利用淋巴细胞中的S途径合成途径

11、合成DNA而增殖。所以多种不同形式细胞的混合体在而增殖。所以多种不同形式细胞的混合体在HAT选择培养液中，只有杂交瘤细胞能存活下来并不断增殖。第二次筛选（图中选择培养液中，只有杂交瘤细胞能存活下来并不断增殖。第二次筛选（图中B过程）：由过程）：由于实验小鼠在注射目标抗原前，其体内已存在大量的病原体，因此小鼠体内会存在大量于实验小鼠在注射目标抗原前，其体内已存在大量的病原体，因此小鼠体内会存在大量的针对不同种类抗原的免疫的针对不同种类抗原的免疫B淋巴细胞淋巴细胞 。所以在细胞融合时产生目标。所以在细胞融合时产生目标 抗体的杂交瘤细胞抗体的杂交瘤细胞才是所需要的。目前筛选出目标抗体的最常用方法是有

12、限稀释法，其基本过程是：将处才是所需要的。目前筛选出目标抗体的最常用方法是有限稀释法，其基本过程是：将处于对数期的杂交瘤细胞用培养液充分稀释后，接种在培养板中（于对数期的杂交瘤细胞用培养液充分稀释后，接种在培养板中（B过程图所示），然后用过程图所示），然后用酶联免疫吸附试验，（简称酶联免疫吸附试验，（简称ELISA，基本原理是酶分子与抗体或抗体分子共价结合，此种，基本原理是酶分子与抗体或抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶与抗体结合后，结合不会改变抗体的的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶与抗体结合后，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色

13、反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本的中相应抗体的量呈正比。此种显色反应可通过深浅与标本的中相应抗体的量呈正比。此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，检测仪进行定量测定，利用上述方法选出针对目标抗原的抗体的阳性杂交瘤细胞。利用上述方法选出针对目标抗原的抗体的阳性杂交瘤细胞。如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？融合后的细胞经选择性培养基培养后，能存活的细胞就是杂融合后的细胞经选择性培养基培养后，能存活的细胞就是杂交瘤细胞。但这些杂交瘤细胞并非都是能分

14、泌所需抗体的细交瘤细胞。但这些杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体的细胞，通常用胞，通常用“有限稀释法有限稀释法”来选择。将杂交瘤细胞稀释，用来选择。将杂交瘤细胞稀释，用多孔细胞培养板培养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让多孔细胞培养板培养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体（常用酶联其增殖。然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体（常用酶联免疫吸附试验法），那些上清液可与特定抗原结合的培养孔免疫吸附试验法），那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续

15、进行有限稀释，一般需进行选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行34次，直次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。该过程即为杂交至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养。瘤细胞的克隆化培养。1、原理：杂交瘤细胞具有两个亲本的特性，即能迅速大量增殖，又能足够数量的单一抗体。2、过程B淋巴细胞骨髓瘤细胞诱导融合B-B细胞B-瘤细胞瘤-瘤细胞选择培养杂交瘤细胞（ B-瘤细胞）克隆化培养抗体检测杂交瘤细胞体外培养小鼠腹腔内增殖单克隆抗体除通过杂交瘤细胞产生单克隆除通过杂交瘤细胞产生单克隆抗体外，还有什么方法？抗体外，还有什么方法？3. 3.单克隆抗体的应用：单克隆抗

16、体的应用：单克隆抗体的优点：特异性强、灵敏度高、产单克隆抗体的优点：特异性强、灵敏度高、产量大量大 作为诊断试剂：准确识别各种抗原物质，并与作为诊断试剂：准确识别各种抗原物质，并与特异性结合特异性结合 优点：优点：准确、高效、简易、快速准确、高效、简易、快速用于用于运载药物：制成运载药物：制成“生物导弹生物导弹”治疗疾病：主要用于癌症治疗治疗疾病：主要用于癌症治疗既不损伤正常细胞，又减少了用药剂量。既不损伤正常细胞，又减少了用药剂量。一种诱导细胞融合的新方法一种诱导细胞融合的新方法一种新细胞一种新细胞灭活病毒灭活病毒杂交瘤细胞杂交瘤细胞一个优势一个优势单克隆抗体特异性强、单克隆抗体特异性强、灵

17、敏度高的优势灵敏度高的优势1 1、科学家用小鼠骨髓瘤细胞与某种细胞融合，、科学家用小鼠骨髓瘤细胞与某种细胞融合，得到杂交细胞，经培养可产生大量的单克隆得到杂交细胞，经培养可产生大量的单克隆抗体，与骨髓瘤细胞融合的是（抗体，与骨髓瘤细胞融合的是（ ） A.A.经过免疫的经过免疫的B B淋巴细胞淋巴细胞 B.B.没经过免疫的没经过免疫的T T淋巴细胞淋巴细胞C.C.经过免疫的经过免疫的T T淋巴细胞淋巴细胞 D.D.没经过免疫的淋巴细胞没经过免疫的淋巴细胞A2.动物细胞融合的目的中最重要的是动物细胞融合的目的中最重要的是-（ ）A.克服远缘杂交不亲和克服远缘杂交不亲和 B. 制备单克隆抗体制备单克隆抗体 C.培育新品种培育新品种 D.生产杂种细胞生产杂种细胞3.动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较中，正确的是动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较中，正确的是（ ）A. 诱导融合的方法完全相同诱导融合的方法完全相同 B.所用的技术